外显子测序也称目标外显子组捕获，是指利用序列捕获技术将全基因组外显子区域捕捉并富集后进行高通量测序的基因组分析方法。外显子捕获测序仅对外显子区域的序列进行测序，相对于基因组重测序成本较低，可以用很小的数据量获得大量有用信息，对研究基因的SNP、InDel等具有很大的优势。

1.使用尖端的外显子捕获测序手段——Ion Proton Ampliseq全外显子捕获测序，同一基因片段能获得覆盖更为均匀的测序结果，使得数据分析结果更为准确；
2.超高测序深度：可发现常见变异及频率低于1%的罕见变异；
3.结合烈冰科技多年的生物信息分析体系和高分文献发表经验，针对不同生物学问题提供定制化分析方案设计。

1、 DNA样品。基因组DNA总量不低于 1ug，电泳必须有一条＞10k 的条带，无降解（主带下无明显弥散条带），无蛋白、RNA 污染；FFPE DNA样本，总量不低于 1ug，片段大于 1000bp 的条带占比＞50%。TE、AE或ddH,O溶解后置于1.5mIEP管中，-20°C保存，干冰运输。
2、 新鲜组织。组织重量50-100mg(黄豆粒大小)，液氮速冻，-80℃保存 (也可保存在RNAlater中，请勿保存在Trizol中)，干冰运输 (RNAlater保存,可冰袋运输)。
3、外周血。外周血2-3ml，EDTA抗凝管(紫色盖)，-80℃保存，避免反复冻融。干冰运输。
4、 FFPE组织切片。厚度8-10 um，组织面积> 1 cm2 (HE染色显示肿瘤细胞比例>50%)，10-20张。常温或4℃保存。常温运输。
5、穿刺组织。穿刺2针，样本直径1-2mm，长度>0.5cm。液氮速冻，-80℃保存。干冰运输。
6、石蜡组织块。组织表面积> 1cm2。常温或4℃保存，常温运输。
7、 细胞样品。1-4 x10⁶细胞(肿瘤细胞培养最好控制在三代以内)。收获细胞后，离心洗涤去除培养液，并转移至1.5 mI RNase-free EP管中，液氮速冻，-80℃保存。干冰运输。
8、 唾液样品(含有脱落的口腔上皮细胞)。提前30min用饮用水漱口，然后唾液采集前不得进食、饮水、吸烟等，尽可能用舌头多刮几次上下颚，同时也可以用牙齿稍微刮一下舌头，保证脱落细胞的数量。用唾液收集管取样(>1ml) ，-80℃保存，避免反复冻融。干冰运输。

实验分组：
肝细胞癌组织样本组（n=106）： 包括原发性肝癌组织和配对癌旁组织，部分样本伴有乙型肝炎病毒感染（HBV+）。
对照组（n=12）： 包括发育不良结节（DNs）、非肿瘤肝组织（包括肝硬化组织）。
细胞实验组： 使用两种HCC细胞系（Huh7和MHCC-97H），分别进行UBE3C敲低（shRNA）与对照组（scramble）实验。

主要技术手段：
全外显子组测序（Exome Sequencing）；Sanger测序验证；免疫组化染色（IHC）；Western blotting等

分析方法：
体细胞突变识别与筛选、基因表达与临床相关性分析、Kaplan-Meier生存分析、Cox比例风险回归模型、蛋白质结构建模与功能预测等

肝细胞癌（HCC）是全球癌症死亡的第二大原因，尤其与慢性乙型肝炎病毒感染密切相关。肝癌的发生涉及多步骤的遗传与表观遗传改变，但目前对驱动HCC发展的关键基因仍知之甚少。泛素连接酶E3家族在蛋白质降解、细胞信号传导和肿瘤发生中发挥重要作用，但其在HCC中的角色尚未被系统研究。

为了探索HCC发生过程中的遗传演变，研究团队通过对同一患者的发育不良结节、两个HCC病灶及外周血样本进行全外显子测序，系统筛选与HCC发生相关的体细胞突变，并聚焦于UBE3C基因的功能与临床意义。

通过对106例HCC样本进行靶向测序，发现16.0%的HCC患者存在UBE3C体细胞突变，主要位于HECT结构域，其中Glu959Lys突变在7例患者中出现，提示其可能具有重要功能。

2.UBE3C促进HCC进展 *在HCC细胞系中敲低UBE3C后，细胞增殖、迁移和侵袭能力显著下降。
*动物实验中，UBE3C敲低显著抑制肿瘤生长和肺转移。
*UBE3C通过诱导上皮-间质转化促进HCC转移，表现为E-cadherin下调、vimentin、N-cadherin和Snail1上调。

在323例HCC患者的组织芯片中，UBE3C高表达与较短的总生存期和早期复发显著相关。 多因素分析显示，UBE3C是HCC复发的独立预后因素。

除HBV相关HCC外，UBE3C突变也见于HCV相关和非病毒性HCC，提示其突变谱可能受病因影响。

结构建模显示，位于HECT结构域的突变（如Glu959Lys）可能影响其与底物结合或催化活性，进而参与肿瘤发生。

本研究通过外显子组测序与系统功能验证，首次揭示UBE3C是HCC中一个高频突变的候选癌基因，其通过诱导EMT促进HCC进展，且其高表达与患者不良预后显著相关。这些发现不仅深化了对HCC发生机制的理解，也为开发靶向UBE3C的HCC治疗策略提供了理论依据。烈冰生物在该研究中承担了外显子测序与生物信息分析工作，为UBE3C的发现与验证提供了关键的测序与数据分析支持。

原文链接：DOI 10.1002/hep.27012