《Gut》——CD177阳性中性粒细胞高表达MMP9介导细胞外基质重构和HGF-α释放驱动ALPPS术诱导肝再生

烈冰生物助力复旦大学附属中山医院肝胆肿瘤与肝移植外科周俭院士团队于近期在国际胃肠病学顶级期刊Gut 杂志发表了题为“CD177+ neutrophils drive extracellular matrix remodelling and HGF-alpha release in ALPPS-induced liver regeneration”的研究论文。

本研究首次阐明了 CD177⁺中性粒细胞在肝再生中的正向调控作用。以联合肝脏分隔与门静脉结扎的二步肝切除术（ALPPS）为研究模型，结合单细胞转录组与空间转录组分析，发现ALPPS诱导的肝再生过程中，肝脏内 CD177⁺中性粒细胞显著富集。机制上，该细胞群通过高表达MMP9介导细胞外基质水解，促进HGF-α释放，从而驱动肝再生。

此外，本研究首次建立保留10%残余肝体积的小鼠ALPPS模型，并结合体内多维验证、肝脏类器官及体外实验，系统证实CD177⁺中性粒细胞可分别通过 CD177–CD31轴与内皮细胞相互作用，以及通过 CXCL8–CXCR1/2轴与肝星状细胞介导肝内浸润，协同促进ECM重构与HGF-α释放。上述发现为主动诱导肝再生及肝衰竭防治提供了新的潜在治疗策略。

本研究中肝脏单细胞捕获测序及数据分析由烈冰生物完成。

发表时间：2025.12

发表期刊：Gut

影响因子：26.2

1、研究背景

ALPPS术是治疗巨大肝癌或多发性肝肿瘤的重要手术方式，可在 1–2 周内使残余肝体积（FLR）增加49%–84%，显著提高肿瘤切除率。然而，其调控肝再生的免疫学机制仍未阐明。本研究聚焦ALPPS术后肝再生过程中免疫微环境的动态变化及其作用机制，旨在为主动诱导肝再生及肝衰竭的防治提供新的理论依据与潜在干预策略。

2、样本设计

发现队列（Discovery cohort）：

收集3例ALPPS患者的6份配对肝脏组织，制备单细胞悬液并用于scRNA-seq测序及后续分析。

验证队列（Validation cohort）：

包括150份配对FFPE组织（75例ALPPS患者）、20例Bulk RNA-seq样本（10例ALPPS患者），以及6张空间转录组芯片，来源于2例ALPPS患者（其中2对样本各测序2张空间转录组芯片）。

功能验证队列（Functional validation cohort）：

构建并验证保留10%残余肝体积的ALPPS小鼠模型，用于体内功能性抑制、阻断及细胞输注实验；同时构建肝脏类器官模型，用于共培养体系及体外功能干预实验；多色荧光染色（mIF）与Migration assay。

单细胞捕获平台：BD Rhapsody

主要技术手段：scRNA-seq、Stereo-seq、多重免疫荧光染色（mIF）等。

1、ALPPS术诱导肝再生过程中伴随中性粒细胞浸润

基于单细胞转录组测序数据分析，发现ALPPS术后肝组织中性粒细胞浸润显著增加（Fig. 1E）。MPO（髓过氧化物酶）免疫组化染色进一步证实了ALPPS术后肝组织中中性粒细胞的明显富集（Fig. 1F）。此外，ALPPS术后动态全血细胞分析显示，外周血中性粒细胞的绝对数量及其比例均显著升高（Fig. 1G）。基于上述结果，后续研究进一步聚焦中性粒细胞在ALPPS术诱导肝再生中的功能作用。

2、中性粒细胞在ALPPS术诱导肝再生中的促进作用

为验证中性粒细胞在肝再生中的促进作用，构建了保留10%残余肝体积的ALPPS小鼠模型。该模型通过结扎左外叶、尾状叶、右叶及右中叶门静脉，并采用双极电凝劈开左中叶与右中叶肝实质实现。于术后 0、1、2、3、4、7 和 10 天 对保留侧肝脏体积及肝细胞增殖情况进行评估（Fig. 2A, B）。

结果显示，术后保留侧肝脏体积呈持续性增长（Fig. 2C），肝细胞增殖在术后 第3天达到峰值，增殖肝细胞比例接近 80%（Fig. 2D）。

同时，对ALPPS术后小鼠保留侧肝脏进行单细胞解离，并采用流式细胞术分析肝组织中免疫细胞、中性粒细胞及CD177⁺中性粒细胞的动态变化。结果显示，中性粒细胞在免疫细胞中的比例自术后第0天至第3天持续升高（Fig. 2E），而 CD177⁺中性粒细胞在中性粒细胞中的占比于术后第2天达到峰值，接近60%（Fig. 2F）。

通过注射Ly6G抗体清除ALPPS术后小鼠体内的中性粒细胞（Fig. 2G）。与对照组相比，中性粒细胞清除组进行ALPPS术的小鼠在术后7天内的存活率显著降低（Fig. 2H），同时保留侧肝脏体积及肝细胞增殖比例均明显下降（Fig. 2I–K）。

综合体内功能实验结果表明，中性粒细胞是ALPPS诱导肝再生所必需的关键免疫细胞群。

3、G4（CD177+）中性粒细胞是诱导肝再生的关键亚群

为鉴定促进肝再生的中性粒细胞亚群，基于单细胞转录组数据对中性粒细胞进行功能性分群分析（Fig. 3A, B）。结果显示，ALPPS术前后G4期中性粒细胞的数量增幅最为显著（Fig. 3C）。

相较于其他中性粒细胞亚群，G4期中性粒细胞显示出多种分泌蛋白及受体相关基因的显著上调，包括 MMP9、S100A12、ARG1、CD177、GRN 和 G6PD（Fig. 3E）。功能富集分析表明，G4期中性粒细胞的上调基因显著富集于糖酵解/糖异生、氨基酸生物合成、脂肪酸生物合成及代谢等代谢相关通路，以及与 组织修复密切相关的信号通路，如血管内皮生长因子（VEGF）信号通路、细胞外基质（ECM）解聚及金属肽酶活性等（Fig. 3F, G）。

进一步的MPO与MMP9免疫荧光染色结果显示，与ALPPS术1期相比，2期肝脏组织中G4期中性粒细胞（MMP9⁺MPO⁺）的浸润显著增加（Fig. 3H）。

综合上述结果，CD177⁺中性粒细胞是一类代谢活跃、具备促再生潜能的功能亚群，在ALPPS术后显著富集，可能作为驱动肝脏再生的关键免疫细胞群。

4、CD177阳性中性粒细胞通过MMP9促进细胞外基质重构和HGF-α释放驱动肝再生

为解析 CD177⁺中性粒细胞促进肝再生的免疫学机制，基于单细胞转录组数据从中性粒细胞的 高分泌蛋白特征 入手进行分析。结果显示，在单细胞数据中，G4期中性粒细胞中MMP9、S100A9和PGLYRP1表达显著升高（Fig. 4A, B）。鉴于 MMP9在细胞外基质（ECM）重构及组织再生中的核心作用，进一步对其功能进行了验证。ELISA结果表明，无论来源于肝组织还是外周血，CD177⁺中性粒细胞分泌的MMP9水平均显著高于CD177⁻中性粒细胞（Fig. 4C)。

为明确 MMP9 在肝再生中的功能性作用，研究者构建了一个基于核酸纳米结构（nucleic acid nanostructure, NAC）的三维肝脏类器官模型。在培养的第 0 天和第 2 天，分别向类器官中加入 5000 个中性粒细胞。同时，在多个时间点给予重组嵌合 IgG4 抗 MMP9 单克隆抗体 Andecaliximab，以特异性抑制 MMP9 活性（Fig. 4D）。

HE 染色、免疫荧光分析及类器官最大切面面积定量结果显示，MMP9 抑制显著缩小类器官体积，并降低 ATP 生成水平，从而抑制肝脏类器官的生长能力（Fig. 4E-H）。进一步在小鼠 ALPPS 模型中证实，抑制 MMP9 明显降低残余肝中肝细胞增殖水平及肝体积增长（Fig. 4K-L），并显著下调 HGF 的表达（Fig. 4M）。

通过 ELISA 检测发现，在采用 Ly6G 抗体清除中性粒细胞的 ALPPS 小鼠模型中，术后第3天（POD3）肝脏内HGF水平较对照ALPPS小鼠显著降低（Fig. 5A）。进一步对残余肝进行细胞组分分离分析表明，中性粒细胞清除主要导致细胞外基质（ECM）中 HGF-α水平明显减少（Fig. 5B）。

在体外类器官模型中，研究者进一步观察到，抗 MMP9 单克隆抗体 Andecaliximab 处理后，类器官培养上清中 ECM 水解产物羟脯氨酸（hydroxyproline, HYP）水平显著下降，同时类器官组织切片中 HGF-α 的表达亦同步降低（Fig. 5D–E）。

功能性挽救实验显示，经尾静脉注射 HGF-α 可显著逆转因 Ly6G 抗体阻断中性粒细胞或 MMP9-IN-1 处理所导致的 ALPPS 小鼠在术后第3天肝细胞增殖比例下降的表型（Fig. 5F–H）。

以上结果表明，CD177阳性中性粒细胞通过分泌 MMP9 介导细胞外基质（ECM）降解与胶原水解，从而促进 HGF-α 的释放，最终驱动肝细胞增殖并加速肝再生。

5、中性粒细胞-内皮细胞通过CD177-PECAM1通讯轴作用介导浸润入肝

为探究中性粒细胞浸润肝脏的调控机制，研究者采用 CellPhoneDB 进行细胞通讯配对分析，发现 CD177阳性中性粒细胞与内皮细胞之间的 CD177–CD31（PECAM1）信号轴显著增强（Fig. 5I）。

Transwell 迁移实验显示，抗体阻断 CD177 或 CD31 均可显著抑制 CD177⁺ 中性粒细胞穿越肝窦内皮细胞（liver sinusoidal endothelial cells, LSECs）的迁移能力，且联合阻断呈现明显的叠加抑制效应（Fig. 5J）。

进一步的空间转录组学分析证实，G4 中性粒细胞在空间上优先富集于内皮细胞邻近区域（Fig. 5L）。在 ALPPS 2期手术后肝组织中，G4 中性粒细胞与内皮细胞共定位的细胞比例约为 0.27%，显著高于其他中性粒细胞亚群（Fig. 5K–M）。

6、肝再生过程中肝星状细胞（HSC）可通过CXCL8-CXCR1/2轴介导中性粒细胞趋化

鉴于 CD177阳性中性粒细胞可与内皮细胞相互作用介导浸润入肝，研究者进一步基于单细胞转录组测序数据系统解析了中性粒细胞被招募至肝脏的潜在分子机制。基因集富集评分分析显示，肝星状细胞（HSC）及胆管细胞中，与中性粒细胞迁移相关的基因特征显著增强（Fig. 6A）。

CellPhoneDB 细胞通讯分析进一步揭示，HSC 与中性粒细胞之间的 CXCL1/CXCL8–CXCR1/2 信号通路显著增强（Fig. 6B），且 HSCs 中 CXCL1 与 CXCL8 的表达水平均处于较高水平（Fig. 6C–D）。上述结果表明，HSC可能通过 CXCL8–CXCR1/2 轴介导趋化信号，从而驱动中性粒细胞向肝脏迁移并聚集。

为验证CXCL1/CXCL8 的趋化功能，研究者开展了体外迁移实验，结果表明 CXCL1 与 CXCL8 均可显著促进 CD177阳性中性粒细胞的迁移，其中CXCL8的作用更强。进一步应用特异性抑制剂阻断 CXCR1 或 CXCR2，可明显削弱 CXCL8 诱导的中性粒细胞迁移能力（Fig. 6E）。

基于单细胞转录组数据对肝星状细胞（HSC）亚群进行精细分群分析，鉴定出一类高表达 CXCL8 的HSC亚群（Fig. 6F）。空间转录组学分析进一步显示，G4 期中性粒细胞（即 CD177⁺ 中性粒细胞）在空间上优先共定位于 CXCL8⁺ HSC 亚群附近，其共定位比例显著高于其他中性粒细胞亚群（Fig. 6G-H）。

综上所述，这些结果表明，CXCL8⁺ 肝星状细胞（HSC）通过 CXCL8–CXCR1/2 趋化轴驱动中性粒细胞的定向迁移与募集，诱导 CD177阳性中性粒细胞在肝脏中的浸润，从而在 ALPPS 过程中促进肝脏再生。

7、体内体外验证CD177缺失会破坏MMP9-HGF-α轴抑制肝再生

本研究进一步结合体外肝脏类器官模型与小鼠 ALPPS 模型，系统验证了 CD177阳性中性粒细胞在促进肝再生中的关键作用。在类器官培养体系中加入 CD177阳性中性粒细胞后，类器官裂解液中总可溶性胶原蛋白水平、培养上清中羟脯氨酸（HYP）释放量及 HGF 浓度均显著升高，同时类器官最大横切面中 HGF-α 表达面积比例明显增加（Fig. 7A-E）。相反，应用 CD177 中和抗体阻断该通路可显著降低上述指标，并伴随 ATP 生成减少及类器官生长面积受抑（Fig. 7F-G）。

上述结果表明，肝脏类器官模型能够有效重现 CD177⁺ 中性粒细胞通过分泌 MMP9 介导 ECM 降解、激活并释放 HGF-α，进而驱动肝细胞增殖的关键分子机制。

本研究进一步结合体外肝脏类器官模型与小鼠 ALPPS 模型，系统验证了 CD177阳性中性粒细胞在促进肝再生中的关键作用。在类器官培养体系中加入 CD177阳性中性粒细胞后，类器官裂解液中总可溶性胶原蛋白水平、培养上清中羟脯氨酸（HYP）释放量及 HGF 浓度均显著升高，同时类器官最大横切面中 HGF-α 表达面积比例明显增加（Fig. 7A-E）。相反，应用 CD177 中和抗体阻断该通路可显著降低上述指标，并伴随 ATP 生成减少及类器官生长面积受抑（Fig. 7F-G）。

上述结果表明，肝脏类器官模型能够有效重现 CD177⁺ 中性粒细胞通过分泌 MMP9 介导 ECM 降解、激活并释放 HGF-α，进而驱动肝细胞增殖的关键分子机制。

综上所述，体内与体外实验一致证实，CD177阳性中性粒细胞在肝脏再生过程中发挥关键促进作用，提示其在主动诱导肝再生及肝衰竭防治中的潜在转化应用价值。

三、研究意义

本研究首次揭示并通过体内与体外实验证实，CD177⁺ 中性粒细胞在 ALPPS 诱导的肝脏再生过程中发挥关键调控作用。机制上，CD177⁺ 中性粒细胞通过 CD177–PECAM1 相互作用及 CXCL8–CXCR1/2 介导的趋化轴被募集并浸润至肝脏，其高水平分泌的 MMP9 促进细胞外基质（ECM）水解并释放肝细胞生长因子-α（HGF-α），从而驱动肝细胞增殖并加速肝再生。该研究所揭示的调控轴为临床主动诱导肝再生及肝衰竭的防治提供了具有潜在转化价值的新策略。

复旦大学附属中山医院肝胆肿瘤与肝移植外科周俭院士和杨欣荣教授为该研究的共同通讯作者。复旦大学附属中山医院肝胆肿瘤与肝移植外科闫加艳医师、黄傲主治医师、张势域博士生、复旦大学肝癌研究所姚娜博士、重症监护室肝外科监护室黄俊峰主治医师为该研究的共同第一作者。