Gastroenterology(IF=25.9)|化疗为何对部分胰腺癌患者无效？研究锁定关键调控因子CD276

烈冰生物助力上海交通大学医学院附属瑞金医院研究团队,于近期在国际消化领域期刊 《Gastroenterology》杂志上发表了标题为“Single-Cell Analysis of Chemotherapy-Induced Remodeling Reveals CD276-Driven Basal-Like Chemoresistance in Pancreatic Cancer” 的研究论文。

本研究基于胰腺导管腺癌（PDAC）患者化疗前后的配对肿瘤活检组织及外周血样本，结合单细胞转录组分析系统解析了化疗过程中肿瘤微环境的动态变化。研究揭示了化疗诱导的恶性细胞状态和免疫微环境的动态重塑。发现了一个以SNCG⁺ 基底样肿瘤细胞、SPP1⁺ 肿瘤相关巨噬细胞和耗竭T细胞为主的耐药微环境，其中CD276/B7-H3被证实是该微环境中促进肿瘤向化疗耐药的基底样状态改变并诱导免疫抑制的双重调控因子，为胰腺导管腺癌治疗提供了潜在靶点,同时为提高胰腺导管腺癌化疗疗效提供了临床见解。

本研究中部分单细胞捕获测序由烈冰生物完成。

发表时间：2026.02
发表期刊：Gastroenterology
影响因子：IF=25.9

一、研究背景与队列设计

1、研究背景

胰腺导管腺癌（Pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC）是预后最差的实体肿瘤之一，其 5年生存率不足10%。由于早期症状隐匿，大多数患者在确诊时已处于晚期阶段。

目前Abraxane联合Gemcitabine（AG方案） 是晚期PDAC的重要一线治疗方案之一。然而临床上不同患者之间治疗反应差异明显，且多数患者最终仍会出现化疗耐药。越来越多研究表明，肿瘤微环境(Tumor microenvironment, TME)在肿瘤化疗反应及耐药形成过程中发挥重要作用,然而化疗过程中肿瘤细胞及免疫微环境的动态变化机制仍缺乏系统研究。

因此，本研究通过单细胞转录组技术系统解析 PDAC在化疗前后肿瘤微环境的细胞组成变化及其分子机制。

2、样本设计

发现队列(Discovery cohort)：

肿瘤样本：共36份（23份治疗前 + 13份治疗后），其中8对为治疗前后配对样本

PBMC样本：共24份（14份治疗前 + 10份治疗后），其中7对为治疗前后配对样本

验证队列(Validation cohort)：

结合独立患者队列及公共数据库数据，对关键调控分子进行表达及预后相关性验证。

功能验证队列(Functional validation cohort)：

通过体外细胞实验及多组学整合分析，对关键分子 CD276 在肿瘤细胞表型转化及化疗耐药中的作用进行功能验证。

单细胞捕获平台：10x Genomics
主要技术手段：ScRNA-seq、ScTCR-seq、ScBCR-seq、免疫组化（IHC）、Visium HD等。

二、研究结果

1、化疗动态重塑PDAC肿瘤微环境

研究者为系统解析化疗过程中肿瘤微环境的动态变化，对PDAC患者化疗前后配对肿瘤样本进行单细胞转录组测序，并对获得的单细胞数据进行质控与整合分析。经严格质控后共保留120,353个细胞,细胞聚类分析后分为:上皮细胞（包括恶性细胞、导管细胞、腺泡细胞和内分泌细胞）、免疫细胞（T细胞/自然杀伤 NK 、B细胞/浆细胞、中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞[DCs]、肥大细胞）、基质细胞（成纤维细胞、胰腺星状细胞、平滑肌细胞、内皮细胞、胶质细胞）以及增殖细胞（图1E-G）。与化疗反应状态一致，应答者在化疗后表现出恶性细胞（P=0.031）和巨噬细胞（P=0.023）的显著减少，同时经典DCs（P=0.018）增加。相比之下，无应答者这些细胞类型的变化微乎其微。相反，他们表现出T/ NK 细胞（P=0.050）的显著减少和中性粒细胞（P=0.042）的增加（图1H-J），这表明应答者与无应答者之间存在不同的 TME 重塑模式。

为评估化疗对循环免疫细胞的影响，将174,141个外周血单个核细胞（PBMCs）分类为CD4⁺ T细胞、CD8⁺ T细胞、自然杀伤细胞（NKs）、增殖性T细胞、B细胞、浆母细胞、中性粒细胞、经典单核细胞、非经典单核细胞、巨核细胞样细胞、浆细胞样树突状细胞（DCs）及2型常规树突状细胞（图1K、L）。结果显示，治疗后应答者与非应答者的增殖性T细胞比例均有所增加（图1M），表明化疗期间外周T细胞广泛激活。

这些结果表明，AG化疗不仅直接作用于肿瘤细胞，同时也会对肿瘤免疫微环境产生深刻影响，从而导致肿瘤组织内的细胞组成发生系统性改变。

2、化疗诱导肿瘤细胞向Basal-like表型转化，与治疗耐药相关

为了进一步解析肿瘤细胞在化疗过程中的变化，研究者对单细胞数据中的肿瘤细胞群体进行二次聚类分析。结果发现，PDAC肿瘤细胞可分为Classical型（FABP1⁺、SPINK4⁺和GPX2⁺）和Basal-like型（SNCG⁺）以及中间共表达型的IC型恶性细胞（LMO7⁺）和一个增殖亚群（表达MKI67和TOP2A）（图2A-C）。通过多重免疫荧光（mIF）染色技术也进一步得到了验证（图2D）。

研究者利用拟时序分析构建了肿瘤细胞的发育轨迹。结果显示，中间共表达型的IC型恶性细胞（LMO7⁺）在化疗压力下既可以向Classical型肿瘤细胞转化，也可以向Basal-like状态转化（图2E）。Classical型肿瘤细胞,表现为典型的上皮分化特征,该亚型通常与相对较好的临床预后相关；而 Basal-like型肿瘤细胞则表现出更强的侵袭性和去分化特征，对 PDAC 预后不利（图F）。进一步比较化疗前后肿瘤亚型的比例变化，研究者发现：Basal-like肿瘤细胞在治疗耐药病人中富集且化疗后进一步显著增加(图2G-H)。

此外，基因表达分析进一步表明：Basal-like肿瘤细胞富集多种与肿瘤侵袭和耐药相关的信号通路（图2I-K）。

这些结果提示，化疗过程中肿瘤细胞并非被简单清除，而是可能通过表型重编程获得更强的适应能力。

3、SPP1⁺肿瘤相关巨噬细胞促进耐药微环境形成

在免疫细胞群体中，研究者进一步对巨噬细胞进行亚群分析。单细胞聚类结果显示，肿瘤相关巨噬细胞（TAM）可被分为多个亚群，显示存在6种巨噬细胞亚型，分别以IL1B、ISG15、Marco、SPP1、FOLR2和ALDH1A为主导表达（图3A–C）。IL1B⁺ 单核样巨噬细胞与炎症相关；ISG15⁺ 巨噬细胞与干扰素信号通路相关；ALDH1A1⁺巨噬细胞与脂质代谢相关；SPP1⁺ 巨噬细胞与缺氧、糖酵解和血管生成等致癌特征相关；而FOLR2⁺ 巨噬细胞则表现出抗肿瘤特性，如抗原呈递和吞噬作用（图3A–C）。其中与正常胰腺组织相比，PDAC组织中FOLR2⁺ 巨噬细胞显著减少而SPP1⁺ 巨噬细胞亚群显著增加，与FOLR2⁺ 巨噬细胞为组织驻留巨噬细胞（TRM）以及SPP1⁺ 巨噬细胞为肿瘤相关巨噬细胞（TAM）的表型一致（图3D）。

研究者随后探究了化疗期间巨噬细胞亚型的动态变化。无应答者仅表现出微小改变，维持高水平的SPP1⁺ 巨噬细胞，而应答者则显示FOLR2+ 巨噬细胞显著增加且SPP1⁺ 巨噬细胞减少（图3E）。应答者还表现出更强的吞噬活性和更低的血管生成，这与FOLR2⁺ 巨噬细胞的募集一致（图3F）。

此外，应答者抗肿瘤基因表达增加，而无应答者则维持高水平的血管生成和M2特征（图3G）。进一步的细胞通讯分析显示，发现促肿瘤的SPP1⁺ 巨噬细胞更多与Basal-like型肿瘤细胞相互作用，而肿瘤的FOLR2⁺ 巨噬细胞则更多与Classical型肿瘤细胞相互作用（图3H）。mIF及细胞间距定量分析证实了SPP1⁺ 巨噬细胞与Basal-like型肿瘤细胞的距离较Classical型肿瘤细胞更近(图3I、J）。这些信号通路可能促进肿瘤细胞的生长、迁移以及耐药能力。在无应答者中，SPP1⁺ 巨噬细胞- Basal-like型肿瘤细胞的配体-受体组合与糖酵解、缺氧及上皮细胞增殖相关（图3K、L）。相比之下，在FOLR2⁺ 巨噬细胞-Classical型肿瘤细胞的应答者中涉及细胞因子信号传导、 TNF 信号传导及炎症反应。

这些发现表明，两种不同巨噬细胞-恶性细胞轴的重塑可赋予 PDAC 对化疗的敏感性或耐药性。

4、化疗同时诱导T细胞耗竭

除巨噬细胞外，研究者还重点分析了肿瘤浸润T细胞的变化。研究者在CD4⁺ T细胞和CD8⁺ T细胞中鉴定出多个亚群，包括初始T细胞、效应记忆T细胞、耗竭T细胞、组织驻留记忆T细胞等（图4A-C)。

在CD8⁺ T细胞中，化疗后无应答者GZMK⁺ 耗竭T细胞、组织驻留记忆T细胞和耗竭T细胞显著增加，而应答者中略有减少（图4D）。分化轨迹分析显示，CD8⁺ T细胞主要朝向Temra或终末耗竭T细胞分化，其中无应答者表现出耗竭T细胞的显著积累及耗竭水平升高，而应答者则表现为耗竭水平降低和细胞毒性增强（图4E-I）。TCR追踪分析显示，与其他CD8亚型相比，Temra亚型中大型或过度扩增克隆的比例更高（图4J）。应答者中，Temra克隆在化疗后出现过度扩增，且新出现的TCR克隆比例显著高于非应答者，这些新克隆主要由细胞毒性Temra细胞构成（图4K）。

上述结果表明，化疗可能通过诱导T细胞耗竭，从而削弱机体的抗肿瘤免疫反应。

5、CD276驱动Basal-like肿瘤细胞耐药微环境生态位

通过不同指标，比如衡量微环境组成的前后变化的动态值、与临床预后协同变化的临床相关因子、基于空间组学（Visium）的空间共分布模式等共同发现了一个以SNCG⁺基底样肿瘤细胞、SPP1⁺ 肿瘤相关巨噬细胞和耗竭T细胞为主的耐药生态位（图5A–C）。进一步，通过免疫荧光染色、ISS及单细胞精度的Visium HD数据分析等证实了这个耐药生态位（图5D-G）。通过对肿瘤细胞进行基因重编程分析，发现免疫检查点分子CD276（B7-H3）在向Basal-like肿瘤细胞转化轴上显著上调，可能是这个耐药生态位的关键调控因子（图2K及图5H-I）。

免疫荧光染色结果及新的临床验证数据集（N=58）进一步证实，在肿瘤组织中CD276与Basal-like肿瘤细胞标志物呈现明显共定位（图5J-L）。

这些结果表明，CD276可能在化疗诱导的肿瘤耐药过程中发挥关键作用。

6、靶向CD276通过双重机制逆转化疗耐药

为验证CD276在化疗耐药中的功能作用，研究者进行了一系列体外及体内实验。体外实验显示，抑制CD276表达可显著降低耐药细胞的增殖能力，并增强肿瘤细胞的凋亡（图6A-C）。

在小鼠肿瘤模型中，无论是细胞系来源的异种移植模型还是KPC基因工程小鼠模型，联合使用CD276阻断策略与化疗均能显著抑制肿瘤生长，并延长小鼠的总生存期（图6D-J）。

这些结果证实，靶向CD276能有效逆转PDAC的化疗耐药。

那么，CD276究竟是如何驱动化疗耐药的？为进一步阐明其作用机制，研究者进行了深入的转录组分析。RNA测序显示，敲低CD276后，肿瘤细胞中与Basal-like状态相关的基因（如糖酵解通路）显著下调，而与Classical状态相关的基因（如胆固醇合成通路）则上调，提示CD276敲低促使肿瘤细胞的转录状态从Basal-like向Classical转变（图7A-B）。

体内单细胞测序同样证实，B7-H3阻断后，肿瘤组织中恶性细胞及Basal-like细胞比例减少，肿瘤细胞向classical状态转变（图7F-I），说明CD276/B7-H3是维持肿瘤细胞Basal-like状态的关键驱动因子。

除直接影响肿瘤细胞外，靶向CD276还能重塑肿瘤免疫微环境。体外共培养实验证实，敲除CD276的肿瘤细胞能显著增强CD8⁺ T细胞的杀伤能力，并减少T细胞的耗竭（图7K-M）。在KPC小鼠模型中，抗B7-H3联合化疗显著增加了肿瘤浸润CD8⁺ T细胞中颗粒酶B的阳性比例，表明其细胞毒性功能得到增强（图7N-O）。同时，B7-H3阻断还上调了肿瘤和巨噬细胞中的人类白细胞抗原和干扰素相关基因，促进了免疫激活（图7J）。

综上，靶向CD276/B7-H3不仅能直接重编程肿瘤细胞，使其从侵袭性强的Basal-like状态向化疗敏感的Classical状态转化，还能逆转免疫抑制微环境，增强CD8⁺ T细胞的抗肿瘤免疫应答。这一双重作用机制使其成为克服PDAC化疗耐药的极具潜力的治疗靶点。

三、研究意义

本研究基于单细胞转录组技术系统解析了胰腺癌化疗过程中肿瘤微环境的动态变化。

研究揭示：

1.AG化疗可同步重塑肿瘤细胞状态及其肿瘤微环境，与治疗结局相关。

2.化疗后不响应病人中形成由 Basal-like肿瘤细胞、SPP1⁺巨噬细胞及耗竭T细胞组成的耐药微环境

3. CD276/B7-H3是驱动化疗耐药微环境形成的关键因子，发挥调控肿瘤状态转变及免疫抑制的双重功能。