烈冰小鼠脑multi-omics 实测｜单细胞+空转+空代，“多维一体”解析脑组织生命组成

图1 多组学联合示意图

在生命科学研究中，越来越多的问题已经不能只靠单一组学回答。例如在脑组织这类高度分区、细胞类型复杂、功能区域明确的样本中，研究者不仅关心“哪些基因表达了”，也关心“这些变化最终是否落实到代谢物层面”。单细胞/单细胞核转录组能够提供细致的细胞组成和基因表达信息，但会丢失细胞的组织空间位置；空间转录组可以保留空间坐标，却不能直接检测真实代谢物。MALDI-2 空间代谢组的价值，正是在组织原位直接解析代谢物分布，把“代谢物在哪里”这件事可视化出来。本测试案例以 C57BL/6 小鼠脑组织为模型，联合 MALDI-2 空间代谢组、Visium HD 空间转录组、单细胞转录组(scRNA-seq) 和单细胞核转录组(snRNA-seq)，构建从脑区结构到细胞组成、从基因表达再到代谢物空间分布的多组学分析流程。在样本取材方面，我们选取两只小鼠的左侧脑组织，分别用于上述组学检测，并尽可能保证不同组学样本来源于相邻或对应的脑区位置，从而提高后续多组学空间配准与整合分析的准确性。

图2 单细胞-空间多组学取材示意图

烈冰生物在神经科学领域积累了丰富的样本处理经验。针对脑组织样本，我们采用了差异化的组织消化(scRNA-seq)与组织制核(snRNA-seq)策略，以更全面地捕获不同细胞类型。

图3 单细胞转录组/单细胞核转录组实验分析流程

结果显示，单细胞转录组数据中主要是各类胶质细胞，包括小胶质细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞等。相比之下，单细胞核转录组数据则以神经元为主，达到了74.93%，同时保留了多类胶质细胞信息。

图4 单细胞转录组/单细胞核转录组细胞组成差异结果

在空间多组学方面，对FSC22包埋后的小鼠脑组织进行连续切片，在相邻组织切片上分别开展MALDI-2空间代谢组检测（正、负离子模式）和Visium HD空间转录组测序，获得空间代谢分布和基因表达特征。

图5 空间多组学实验流程

最后联合单细胞转录组、单细胞核转录组、空间转录组、空间代谢组（正、负离子模式），构建脑组织多维空间分子图谱，实现代谢分布、基因表达与细胞类型在组织空间中的精准定位，从而解析脑组织区域特异性的分子特征及细胞功能状态。

01 MALDI-2空间代谢组学实验部分

本次测试针对C57BL/6成年小鼠脑组织进行研究。

· 样本制备：解剖小鼠获取新鲜脑组织，经FSC22包埋剂包埋并低温速冻;

· 样本质控：通过RNA质检和H&E染色评估样本质量;

· 切片制备：使用 Leica 切片仪获得 10 μm 组织切片，贴附于 ITO 导电玻片上，并进行光学扫描;

· 基质喷涂：本次实验选择 DHB 和9-AA作为基质，分别采用合适方法均匀喷涂于组织表面;

· 激光设置：MALDI-2（355 nm 主激光解吸/电离 + 266 nm 第二束激光进行后电离）;

· 检测模式：Positive ion mode（正离子检测模式），Negative ion mode（负离子检测模式）;

· 检测范围：m/z 50～1000;

· 空间分辨率：50 μm。

图6 实验流程

在 MALDI-2空间代谢组研究中，基质选择是影响代谢物检出和成像质量的重要环节。基质能够辅助组织中的小分子、脂质等成分完成解吸和电离，不同基质适合的离子模式和代谢物类型有所不同，因此通常需要根据样本类型和研究目标进行选择。

本实验采用 DHB 和 9-AA 两种常用基质。其中，DHB 更常用于正离子模式，适合获取较丰富的整体代谢物信息，尤其适用于脂质及多类组织内源性代谢物的空间成像；9-AA 更常用于负离子模式，对酸性代谢物、核苷酸、有机酸具有补充价值。通过 DHB 与 9-AA 的组合，可以在空间代谢组检测中兼顾整体代谢覆盖与特定类别分子的补充检出，为后续代谢物空间分布展示和多组学联合分析提供更全面的数据基础。

表1 常用基质的选择

02MALDI-2空间代谢组学数据分析部分

图7 空间代谢组数据分析流程

通过烈冰生物搭建的空间代谢组数据分析流程，我们对 MALDI-2 空间代谢检测数据进行了系统解析。以 DHB 正离子模式结果为例，小鼠脑组织中可检测到丰富的代谢物信号，并保持了较高的注释水平：10 ppm 注释率达到 96.70%，5 ppm 高可信注释率达到 88.82%，整体表现与其他小鼠组织样本接近，说明该流程在脑组织空间代谢检测中具有良好的适用性和稳定性。

进一步对注释代谢物进行分类后可以看到，小分子代谢物和脂质类占据主要比例；在二级分类层面，数据覆盖了甘油磷脂、脂肪酸、有机酸、氨基酸及核苷酸相关代谢物等多类核心代谢成分。这表明 MALDI-2 空间代谢组不仅能够在脑组织中获得较丰富的代谢物信息，也能够较好反映组织内主要代谢组成，为后续代谢物空间分布展示和多组学联合分析提供可靠的数据基础。

图8 DHB正离子模式下，小鼠脑组织的空间代谢分析结果

在 9-AA 负离子模式下，小鼠脑组织共检测到 332 个 m/z features，数量低于 DHB 正离子模式。这与 MALDI-MSI 空间代谢组的常见检测特点一致：正离子模式更适合获得丰富的整体代谢信号，而负离子模式更偏向于捕获酸性代谢物、酸性脂质、有机酸及部分核苷酸相关分子。虽然 9-AA 负离子模式检出特征数量相对较少，但注释结果表现较好，10 ppm 注释率达到 99.40%，5 ppm 高可信注释率达到 91.87%。分类结果显示，脂质类和小分子代谢物占据主要比例，二级分类中覆盖了甘油磷脂、脂肪酰类、有机酸及衍生物、氨基酸及衍生物、核苷/核苷酸等类别。

图9 9-AA负离子模式下，小鼠脑组织的空间代谢分析结果

进一步与 DHB 正离子模式比较发现，两种模式共享的 m/z feature 仅 44 个，说明二者在代谢物覆盖范围上具有明显互补性。部分酸性或磷酸化相关分子，如亚油酸、亚麻酸、葡萄糖-6-磷酸、丙酮酸等，在 9-AA 负离子模式下更容易被观察到。因此，9-AA 并不是替代 DHB，而是对 DHB 正离子检测的重要补充。正负离子模式联合使用，可以拓展代谢物覆盖范围，使空间代谢组结果更加全面，为后续代谢通路解析和多组学联合分析提供更充分的分子信息。

图12 9-AA负离子模式下，特异性检出的代谢物

我们进一步利用 SSC 空间聚类分别对正、负离子模式下的空间代谢数据进行区域划分，来评估组织内部不同功能区域的空间异质性。结果显示，无论在正离子模式还是负离子模式下，代谢物的空间分布特征均能够有效区分主要脑区，说明两种检测模式均可反映脑区间的代谢差异，并从不同离子化维度共同揭示脑组织的空间功能分区。

图13 正/负离子模式下，空间聚类分群结果

基于空间代谢组结果，可以进一步计算不同脑区的代谢模块评分。结果显示，不同脑区存在显著的代谢功能分区。下丘脑（HY）表现出最强的区域特异性，显著富集谷氨酸-GABA递质循环、精氨酸-NO/多胺代谢、谷胱甘肽氧化还原、脂肪酸β氧化、支链氨基酸补充代谢模块，提示其具有高度活跃的能量感知与代谢稳态调控功能。腹侧纹状体/纹状体样杏仁核（STRv_sAMY）则富集胆碱-磷脂膜稳态、鞘脂、磷脂酰肌醇信号模块，提示该区域具有显著的脂质介导神经调节特征。大脑皮层（CTX）主要表现为膜脂重塑、鞘脂代谢、一碳代谢和磷脂信号增强。

图14 不同脑区代谢模块评分结果

03从空间代谢到单细胞-空间多组学

如果只看空间代谢组，我们可以知道某些代谢物在哪些脑区富集；但如果进一步联合空间转录组和单细胞/单细胞核测序，就可以继续追问：这些代谢差异对应哪些脑区？可能与哪些细胞群有关？是否与特定通路激活度一致？

本项目通过 Visium HD 空间转录组进行脑区划分和基因表达分析，结合 scRNA-seq 与 snRNA-seq 提供细胞类型参考，再将 MALDI-2 空代信号映射到相应空间区域。这样，空间代谢组不再是独立结果，而是进入了“脑区 - 细胞 - 基因 - 代谢物”的联合解释体系。

这一点正是空间多组学的核心价值：不是把多种数据简单放在一起，而是让不同组学回答不同层面的问题。

· 空间转录组回答：不同脑区和空间位置的基因表达有何差异？

· 单细胞/单细胞核测序回答：这些信号可能来自哪些细胞类型？

· 空间代谢组回答：真实代谢物是否也在相应脑区呈现特异性分布？

通过整合单细胞与单细胞核两部分数据，我们构建了较为完整的脑组织细胞参考图谱，并进一步联合空间转录组测序数据进行空间维度的细胞类型注释，最终获得了脑组织中不同细胞类型的空间分布结果。

图15 单细胞/单细胞核转录组测序联合空间转录组数据分析

由于空间转录组与空间代谢组采用邻近切片进行检测，两者在组织形态和空间结构上具有较高一致性。通过空间坐标配准，可将两类组学数据映射到统一的组织空间中，从而在空间层面观察基因表达特征与代谢物分布之间的共定位关系。

图16 空间层面基因和代谢物的共定位特征

结合空间转录组对细胞类型空间分布的解析、组织原位检测到的基因表达信息，以及空间代谢组中代谢物的空间分布特征，我们可以获得空间区域划分-细胞组成-空间代谢分群的特征，以及可以进一步构建了细胞类型-基因-代谢物空间关联网络。以皮层区域为例，不同细胞类型、局部表达基因与相关代谢物之间形成了空间关联结构，提示皮层区域内细胞组成、转录状态与代谢活动之间存在协同变化。

图18 小鼠皮层中细胞类型-基因-代谢物的关联分析结果

      为了进一步连接转录组和代谢组，我们利用 scFEA 从空间转录组层面推断代谢通路激活度，并与 MALDI-2 检测到的候选代谢物空间分布进行对照。以神经递质代谢为例，空间转录组可以提示相关通路在不同脑区中的活跃程度，而空间代谢组可以进一步展示 Choline、GABA、Glutamate、Glutamine 等候选代谢物的空间分布。这种组合让分析从“转录层面的通路推断”进一步走向“代谢物层面的空间证据”。对于希望构建机制假设的研究而言，这种互证关系比单一组学更有说服力。

图19 空间转录组-空间代谢物整合的神经递质代谢结果

04空间多组学从“表达图谱”走向“功能证据”

     空间组学研究正在从“看见基因表达在哪里”进一步走向“理解组织中真正发生了什么”。在这个过程中，空间代谢组提供了非常关键的一层信息：真实代谢物的空间原位分布。MALDI-2 空间代谢组与 Visium HD、scRNA-seq、snRNA-seq 的联合，不仅能够展示脑组织中的代谢空间异质性，还可以把代谢物与脑区结构、细胞组成和通路激活度连接起来。

     在实际项目中，空间代谢组可以服务于多种研究场景：

· 用于发现组织内不同区域的代谢异质性。

· 用于验证空间转录组提示的代谢通路变化。

· 用于筛选区域特异性候选代谢物和脂质分子。

· 用于与单细胞/单细胞核数据联合，构建细胞来源和功能通路假设。

· 用于肿瘤、脑科学、免疫微环境、发育和疾病模型等多种空间多组学研究。

     对于希望从组织空间中寻找功能线索、机制假设和候选代谢标志物的研究者来说，MALDI-2 空间代谢组不只是空间多组学的补充模块，更是把机制链条推向代谢功能层面的关键证据。

     依托多年在单细胞和空间转录组领域的技术积累，烈冰生物进一步联合空间代谢组学，构建了覆盖细胞组成、基因表达与代谢分布的多组学分析体系。本次小鼠脑组织单细胞/空间多组学分析结果表明，烈冰生物可提供从单细胞与空间组学实验实施，到多组学数据整合分析和结果交付的完整服务，可为研究者提供更丰富、更深入的研究视角。欢迎有相关检测需求的老师与我们联系交流。