近日,中山大学附属第一医院匡铭教授及其研究团队在国际知名期刊《Cancer Discovery》发表题为 “Senescent-like neutrophils shape angiogenic immunosuppressive niches in colorectal cancer liver metastasis”的研究论文。该研究聚焦结直肠癌肝转移（CRLM）中肿瘤相关中性粒细胞（TANs）的异质性与促肿瘤机制，通过中性粒细胞富集单细胞转录组测序，系统解析了CRLM微环境中BHLHE40⁺衰老样中性粒细胞的来源、功能及治疗靶向价值。烈冰负责单细胞转录组测序实验。

一、研究背景与研究设计

1. 研究背景

结直肠癌肝转移是结直肠癌患者死亡的重要原因。虽然免疫检查点抑制剂已在多种肿瘤中取得突破，但在CRLM中的整体疗效仍然有限，提示肝转移灶中存在复杂的免疫抑制微环境。中性粒细胞是肿瘤免疫浸润的重要组成部分，既可能参与抗肿瘤免疫，也可能通过促进血管生成、细胞外基质重塑和免疫抑制推动肿瘤进展。

但中性粒细胞具有寿命短、体外易损伤、mRNA含量低等特点，传统单细胞测序往往难以高效捕获和解析其异质性。因此，如何在单细胞水平获得高质量中性粒细胞图谱，并进一步联系其功能状态、空间位置和患者预后，是CRLM肿瘤微环境研究中的关键难点。

2. 样本设计

临床队列：研究首先基于CRLM患者及非转移性CRC患者样本，系统评估中性粒细胞浸润与肿瘤分期、肝转移及患者预后的关系。CRLM预后分析队列纳入127例患者，并根据肝转移灶中MPO⁺中性粒细胞密度进行分组，评估其与RFS和OS的关联。

单细胞发现队列：研究对6例CRLM患者样本进行中性粒细胞富集后的单细胞RNA测序，样本包括外周血（PB，n=6）、肝转移灶（CRLM，n=6）、癌旁肝组织（LP，n=6）及原发结直肠肿瘤（CRC，n=5）。其中5例为原发灶、肝转移灶、癌旁肝组织及外周血配对样本。

样本设计与技术路线

单细胞实验策略：考虑到中性粒细胞低转录本和易损伤特性，研究先通过FACS分选富集中性粒细胞，再与其余活细胞混合进行测序。质控后共获得79,285个细胞，其中包括52,198个中性粒细胞，为后续TAN亚群解析提供了足够的数据深度。

空间转录组验证 TAN1_LGALS3 相关生态位特征

组织与功能验证：研究结合IHC、IF、多重免疫组化、流式细胞术、体外共培养、BHLHE40敲低/过表达、ChIP、ATAC-seq以及小鼠CRLM模型进行机制验证。Stereo-seq空间转录组数据主要用于验证TAN1_LGALS3在组织中的分布及其与血管、巨噬细胞等成分构成的生态位关系。

主要分析方法：基于单细胞数据完成细胞类型注释、中性粒细胞亚群重聚类、差异表达分析、通路富集、scMetabolism代谢评分、CytoTRACE/Monocle2拟时序分析、SCENIC转录调控分析、METAFlux代谢通量推断及CellChat细胞通讯分析等。

二、研究结果

1. 中性粒细胞在CRLM中显著富集，并与患者不良预后相关

研究首先比较原发CRC与肝转移灶的免疫细胞组成，发现中性粒细胞在肝转移灶中显著富集，并通过MPO免疫荧光染色得到验证。进一步分析显示，IV期CRC样本中的中性粒细胞浸润显著高于I-III期，转移性CRC中的中性粒细胞密度约为非转移性CRC的1.5倍，提示中性粒细胞浸润与肿瘤转移进展密切相关。

在127例CRLM患者队列中，按照肝转移灶MPO密度高低分组后，高中性粒细胞浸润患者的无复发生存（RFS）和总生存（OS）均显著更差，多因素Cox分析进一步支持其预后相关性。功能层面，小鼠CRLM模型中输入骨髓来源中性粒细胞可促进肝转移灶形成和肿瘤生长，而抗Ly6G抗体耗竭中性粒细胞则抑制肝转移进展。

这一部分结果为全文提供了明确的临床与功能起点：CRLM中性粒细胞并非单纯旁观者，而是与肝转移进展和患者预后直接相关的促肿瘤免疫成分。

图1 中性粒细胞在CRLM中的临床意义与促肿瘤功能

2. 单细胞测序构建CRLM中性粒细胞图谱，锁定TAN1_LGALS3关键亚群

为进一步解析中性粒细胞内部异质性，研究对组织来源中性粒细胞和外周血中性粒细胞分别进行重聚类。组织样本中共识别出5类肿瘤相关中性粒细胞亚群:TAN0_ELL2、TAN1_LGALS3、TAN2_HSPA1B、TAN3_IFIT2和TAN4_ARG1；外周血中识别出3类PMN亚群：PMN0_CXCR4、PMN1_S100A12和PMN2_IFIT1。

不同TAN亚群呈现明显的功能分化：TAN0_ELL2富集细菌反应相关通路，TAN2_HSPA1B与蛋白折叠相关，TAN3_IFIT2具有干扰素刺激特征，TAN4_ARG1与脂多糖反应相关；其中TAN1_LGALS3高表达VEGFA、LGALS3、LDHA和BHLHE40，并富集糖酵解及血管生成相关特征，是全文重点关注的促肿瘤中性粒细胞亚群。

细胞比例分析显示，TAN1_LGALS3在CRLM肝转移灶中显著富集，而在原发CRC及癌旁肝组织中比例较低。结合已发表CRLM单细胞数据进行交叉验证后，该亚群同样能够被识别，说明其并非单一队列中的偶然发现。空间数据也支持TAN1相关特征在CRLM组织中更明显，但在本文解读中主要作为单细胞发现的组织层面验证。

图2 单细胞测序解析CRLM中性粒细胞异质性，并发现TAN1_LGALS3亚群在肝转移灶中富集

3. TAN1_LGALS3呈现糖酵解增强与衰老样表型，并在CRLM局部微环境中形成

在功能特征上，TAN1_LGALS3具有显著增强的糖酵解活性。scMetabolism评分显示，该亚群的糖酵解signature score高于其他TAN亚群及外周血PMN，提示其在肝转移微环境中发生了明显的代谢重编程。

与此同时，TAN1_LGALS3高表达BHLHE40，并表现出衰老相关特征：其细胞衰老评分和SenCID评分升高，SASP相关基因IL1A、SPP1、CXCL8、CSTB表达增强，CDKN1A（p21）表达升高。多重免疫组化和流式SA-β-Gal实验进一步支持LGALS3⁺中性粒细胞具有更明显的衰老样表型。

拟时序分析进一步揭示，外周血PMN处于早期状态，而TAN1_LGALS3位于CRLM中性粒细胞分化轨迹末端。该TAN1样群体在外周血和骨髓数据中并不明显，提示它更可能是在肝转移局部微环境中由其他TAN亚群经组织塑造而来，而不是直接从外周血大量募集形成。体外肿瘤细胞共培养也可诱导外周血中性粒细胞上调BHLHE40、CDKN1A、LGALS3、VEGFA和LDHA，进一步证明肿瘤微环境能够推动TAN1样转化。

图3 拟时序与体外共培养分析提示TAN1_LGALS3是在CRLM局部微环境中形成的终末分化样中性粒细胞状态

4. BHLHE40是驱动TAN1_LGALS3促肿瘤极化的核心转录调控因子

为了寻找TAN1_LGALS3形成的关键调控因子，研究基于SCENIC进行转录调控网络分析，发现BHLHE40在TAN1_LGALS3中具有最高水平的转录调控活性。进一步在dHL60中性粒样细胞中进行BHLHE40敲低和过表达实验，结果显示BHLHE40敲低可显著降低LGALS3、VEGFA、LDHA和CDKN1A表达，而过表达则促进这些基因上调。ChIP实验进一步证明BHLHE40可直接结合这些基因的启动子区域。

研究进一步从肿瘤代谢角度解释BHLHE40上调原因。单细胞数据和METAFlux分析显示，肝转移肿瘤细胞相较原发CRC肿瘤细胞具有更强的糖酵解及葡萄糖/氧气摄取能力，提示其可能消耗局部葡萄糖并造成葡萄糖匮乏微环境。在低糖条件下培养健康供者中性粒细胞，可诱导BHLHE40蛋白、Galectin-3表达和糖酵解活性上调；ATAC-seq还显示低糖条件下BHLHE40启动子区域染色质开放性增强。

由此形成一条清晰机制链：肝转移肿瘤细胞代谢活跃，导致局部葡萄糖竞争与低糖应激；中性粒细胞在该环境中上调BHLHE40，进而启动LGALS3、VEGFA、LDHA、CDKN1A等促肿瘤和衰老相关转录程序，形成TAN1_LGALS3状态。

图4 BHLHE40驱动中性粒细胞向TAN1_LGALS3促肿瘤表型极化

5. TAN1_LGALS3通过VEGFA和CCL3L1-CCR1塑造血管化免疫抑制生态位

功能评分显示，TAN1_LGALS3在血管生成和髓系细胞募集方面显著增强，并高表达VEGFA、CXCL8、CCL3L1、CCL4等细胞因子/趋化因子。组织层面，TAN1_LGALS3密度与CD31⁺血管内皮标志显著正相关；体外实验中，LGALS3⁺中性粒细胞可更强地促进HUVEC管腔形成，说明该亚群具有明确的促血管生成作用。

在髓系细胞互作方面，研究重聚类单核/巨噬细胞后识别出Macrophage_C1QB、Macrophage_CD5L、Macrophage_SPP1、Monocyte_EREG、Monocyte_FCGR3A和Monocyte_FCN1等亚群。CellChat分析显示TAN1_LGALS3与多类单核/巨噬细胞存在较强通讯，其中CCL3L1-CCR1轴可能介导其对免疫抑制性巨噬细胞的募集；CCR1抑制剂或抗CCL3L1中和抗体可削弱LGALS3⁺中性粒细胞条件培养基诱导的巨噬细胞趋化。

多重免疫组化和空间数据进一步显示，BHLHE40⁺p21⁺中性粒细胞、CD68⁺巨噬细胞和CD31⁺血管内皮细胞可在CRLM组织中形成空间邻近的生态位。结果表明TAN1_LGALS3不仅在转录组层面具有促血管生成和髓系募集特征，也在组织结构层面与血管和免疫抑制性巨噬细胞相邻，构成有利于肿瘤进展的血管化免疫抑制微环境。

图5 TAN1_LGALS3具有促血管生成和髓系细胞募集功能，并通过CCL3L1-CCR1轴招募巨噬细胞

图6 TAN1_LGALS3与巨噬细胞、血管内皮细胞共同构成CRLM血管化免疫抑制生态位

6. 靶向中性粒细胞BHLHE40可重塑免疫微环境并抑制CRLM进展

为验证BHLHE40是否具有治疗靶向价值，研究构建了中性粒细胞特异性Bhlhe40条件性敲除小鼠（Mrp8-Cre; Bhlhe40 flox/flox），并建立CRLM模型。结果显示，中性粒细胞特异性Bhlhe40敲除可显著降低肝转移肿瘤负荷，减少中性粒细胞、巨噬细胞和血管内皮细胞浸润，同时增加CD8⁺T细胞浸润，提示抗肿瘤免疫被重新激活。

进一步对WT和Bhlhe40敲除小鼠肝转移肿瘤进行单细胞测序后发现，敲除组中中性粒细胞比例下降，T/B细胞比例升高，T细胞活性和细胞毒性增强；单核/巨噬细胞免疫抑制基因Il10、Spp1、Arg1表达下降。中性粒细胞重聚类后识别出mTan0_S100a9、mTan1_Hsp90ab1和mTan2_Lgals3三个亚群，其中mTan2_Lgals3主要富集于WT肿瘤，并具有糖酵解增强、衰老评分升高和Vegfa表达升高等特征，与人CRLM中的TAN1_LGALS3高度相似。

这些结果从遗传学层面证明，BHLHE40并非TAN1_LGALS3的旁观标志，而是维持免疫抑制性中性粒细胞生态位的重要驱动因子。靶向该轴有望破坏CRLM中“中性粒细胞-巨噬细胞-血管内皮”促肿瘤网络，并恢复T细胞介导的抗肿瘤免疫。

图7 中性粒细胞特异性BHLHE40敲除抑制CRLM进展并恢复抗肿瘤免疫

三、研究意义

本研究以中性粒细胞这一传统单细胞测序中较难捕获的细胞类型为核心，通过中性粒细胞富集策略与单细胞转录组测序，构建了CRLM中高质量TAN图谱，系统揭示了TAN亚群的组成、状态转化和功能差异。

从机制层面看，研究提出了“肝转移肿瘤细胞代谢增强-局部葡萄糖匮乏-BHLHE40上调-TAN1_LGALS3形成-血管生成与免疫抑制性巨噬细胞募集-CRLM进展”的完整链条，将肿瘤代谢竞争、先天免疫重塑和肿瘤血管化生态位有机联系起来。

从临床转化角度看，BHLHE40⁺LGALS3⁺衰老样中性粒细胞与CRLM不良预后相关，且中性粒细胞特异性Bhlhe40敲除可显著抑制肝转移进展，提示BHLHE40、LGALS3、VEGFA及CCL3L1-CCR1轴可能成为评估CRLM免疫抑制状态和开发中性粒细胞靶向治疗的重要方向。

从技术服务角度看，该研究充分体现了单细胞测序在复杂肿瘤微环境解析中的价值：不仅能够识别关键细胞亚群，还可以进一步结合转录调控、代谢评分、拟时序、细胞通讯和动物模型结果，支撑从“细胞图谱”到“机制闭环”的完整研究设计。对于以中性粒细胞、粒细胞、髓系细胞等低转录本/易损伤细胞为核心的肿瘤免疫研究，本研究也提供了很好的样本处理和分析范式。