单细胞转录组测序是在单细胞水平上高通量测序分析基因表达谱的技术，突破传统高通量测序的局限性，组织解离后，一次上机能捕获500-20000个细胞，基于每个细胞分别建库测序，获得单个细胞的基因结构和基因表达状态，并鉴定细胞的类型，可以在不同样本间从细胞类型的组成和丰度角度进行比较，反映细胞间的异质性。

动态微流控

静态蜂巢版

1.单细胞测序技术：公司拥有行业认可的10X Genomics、BD Rhapsody以及烈冰自研的单细胞平台，实现高质高效的单细胞测序。

2.多样化的样本处理经验：公司具有丰富的单细胞悬液制备经验，50+组织类型，100+细胞类型、10000+样本处理经验，确保细胞的活性能够达到测序要求，从而获得可靠的单细胞数据。

3.高效的文库构建技术：公司拥有成熟的单细胞测序文库构建技术和自动化建库平台，一次性完成1000-10000个细胞的文库构建。

4.完善的质控流程和数据分析经验：烈冰自研的CytoNavigator 百万级通量数据分析系统确保数据的可靠性和质量，同时能够提供个性化、定制化的数据分析服务，帮助研究人员从海量的单细胞数据中获取有意义的信息。

样本类型：
组织、血液、培养的细胞系、制备好的单细胞悬液
注：若客户样本为组织，且无能力进行组织解离来获取单细胞悬液，烈冰将尽可能提供技术及实验上的帮助，但因不同类型样本的特异性，无法保证实验方法适用于所有类型组织。

质量要求：
1. 细胞活性大于70%
2. 浓度为500-2000细胞/μl
3. 体积不小于200μl
4. 细胞培养基及缓冲液不能含Ca2+和Mg2+
5. 细胞体积小于40μm

实验分组：
Batch1：13例前列腺癌肿瘤组织样本（12例原发、1例淋巴结转移）；
（10x Genomics平台）
Batch2：1例原位前列腺癌、1例肿瘤微转移淋巴结、1例正常淋巴结样本；
（BD Rhapsody平台）
Batch3：2例正常前列腺、2例惰性前列腺癌、2例恶性前列腺癌、5例CRPC耐药肿瘤
（BD Rhapsody平台）

捕获平台：
10x Genomics& BD Rhapsody

主要技术手段：
scRNA-seq、流式细胞术、RT-qPCR、RNA-FISH、免疫荧光、Western Blot、RNA-seq等。

分析方法：
细胞聚类分析，subCluster分析，差异基因表达分析，GO/Pathway分析，Cellphone分析，QuSAGE分析、拟时序分析等。

前列腺癌具有显著的临床异质性，尤其体现在空间和克隆基因组的多样性上，但其转录组异质性相关研究相对较少。本研究对13个前列腺肿瘤中的36424个单细胞进行转录组分析，发现导致疾病侵袭性的上皮细胞，并观察到肿瘤微环境（TME）中多个与疾病进展相关的转录组程序被激活。同时，发现KLK3广泛表达且癌细胞可改变T细胞转录组，进一步发现KLK3异位表达与微转移有关，并通过细胞间密切通讯，确定了一组能与肿瘤细胞活跃交流的内皮细胞（即激活的内皮细胞，aECs）。测序发现aECs在去势抵抗性前列腺癌中富集且可促进癌细胞侵袭，研究还开发了用户友好的网页界面以方便探索这些测序数据。

通过拷贝数变异分析、肿瘤细胞的 marker 基因/信号通路相关性分析，将上皮细胞鉴定为 luminal types、cell-cycle 、basal/intermediate 类型；我们主要研究了这些细胞类型与临床预后的关系，发现特异性表达细胞因子 CCL2 的 basal/int.亚群与前列腺癌有较好的预后关系；而 cell-cycle细胞亚群则与前列腺癌预后呈负相关。

在 T 细胞的研究中，我们惊奇的发现，T 细胞竟然表达前列腺癌特异性基因 KLK3，深入挖掘分析多种类型的单细胞公共数据库发现 T 细胞均表达相应的肿瘤标记基因的广泛特征。

接下来，以 KLK3 为中心，进行了基因与亚群功能相关性分析、基因共表达网络分析，发现 KLK3 与细胞外囊泡（EV）和外泌体 PSA 相关通路被激活，这提示我们肿瘤可能通过分泌 EV 介导 KLK3 转移至 T 细胞并降低其杀伤功能，为了证明该途径的可行性，我们反复通过流式分选、RNA 荧光原位杂交、免疫组化等验证实验，发现了表达 PSA/KLK3 的 T 细胞，进一步证实肿瘤细胞通过外泌体驯化 T 细胞使其表达与肿瘤转移相关的肿瘤标记基因。

那 EV 转移是否会影响附近淋巴结（LNs）以及影响程度如何呢？我们又设计了前列腺癌淋巴结转移样本（Batch2）进行单细胞测序，同样地发现所有肿瘤样本的 T 细胞普遍高表达 KLK3。

有趣的是，其中一例前列腺癌患者的 MRI 影像及术后病理均提示左右两侧髂外淋巴结为阴性，而 scRNA-Seq 细胞亚群统计显示右侧淋巴结组织中存在高表达 KLK3 的 T 细胞，提示这可能已经形成了「转移前癌巢」结构；而左侧淋巴结组织中不仅存在高表达 KLK3 的 T 细胞，还存在恶性上皮细胞，即左侧淋巴结已发生了临床无法识别的微转移灶。

除了这一发现，我们还注意到 Batch2 样本采用 BD Rhapsody 平台进行单细胞分选时，我们分析存在一群中性粒细胞，而 Batch1 样本采用 10X Genomics 分选平台的数据中没有分析到中性粒细胞的存在。

我们从signature 基因、pathway和转录因子等多角度完整描述了基质细胞的高度异质性，并在内皮细胞（EC）中发现有一部分高表达肿瘤相关性成纤维细胞（CAF）的相关特征基因，将其命名为激活的内皮细胞（aECs）。通过细胞通讯分析，发现 aEC 与上皮细胞有强作用关系，提示其可能影响肿瘤的进展。

于是，重新设计 11 例不同时期前列腺癌样本（Batch3），分选出内皮细胞进行单细胞测序，通过拟时序分析发现 aEC 细胞大部分均来源于 CRPC 样本，其亚群占比随肿瘤进展至 CRPC而逐步升高，表明 aEC 细胞亚群与前列腺癌恶性进展为 CRPC 密切相关。

我们利用流式分选，证明了大部分 aEC 细胞亚群来自于 CRPC 样本；通过共培养发现 aEC 细胞亚群能够提高前列腺癌细胞的侵袭能力，这些实验都证实了 aEC 这一细胞亚群在前列腺癌发生发展过程中起着重要的作用。

本研究通过巧妙地实验样本设计、深入地 scRNA-Seq 数据分析和验证实验，阐述了前列腺癌淋巴结转移的潜在分子机制，并发现了一群与肿瘤进展相关的新细胞亚型，对前列腺癌新型治疗策略和预后指导具有重要意义。

原文链接：https://doi.org/10.1038/s41556-020-00613-6