空间转录组学（Spatial Transcriptomics）是指在组织切片上完成，保留样本空间信息的组学研究。空间转录组可展示组织切片中不同区域的基因表达情况，揭示精细病理区域中激活的信号通路，完成分子特征驱动病理特征的机制解析。空间转录组学完成了病理数字化结合病理影像化的技术革新，对于诊断标志物、耐药位点以及靶向药物的研发，免疫治疗等新兴领域都具有重要作用。

1、 拥有先进的冷冻切片机LEICA CM1950。搭配切片经验丰富的实验团队，对多种组织类型的切片厚度与切片温度进行测试优化，为获得示组织内真实表达水平的高质量冷冻切片提供硬件和技术保障。

2、 拥有行业先进的3DHISTECH公司的PANNORAMIC系列的数字切片扫描仪，可以同时实现明场与荧光场下冷冻切片的快速扫描成像；Z-Stack多层聚焦扫描及Extended Focus 景深扩展多层融合扫描模式，进一步提升分辨率和清晰度，保证切片高分辨的数字图像信息精准采集；

3、 具备丰富的空间转录组测序和数据分析经验，具有完善的空间转录组联合单细胞转录组数据分析方案，能够实现个性化、定制化地数据分析服务。

4、 烈冰提供空间转录组全流程服务，包括样本包埋、切片、选片、HE染色、组织透化、建库测序、以及后续的FISH验证等各个步骤，为您提供无忧服务。

样本类型：OCT包埋冰冻组织、FFPE组织
OCT包埋组织：新鲜组织异戊烷速冻后进行OCT包埋，或新鲜组织直接OCT包埋后-80℃速冻。
FFPE组织：可以是前期保存的石蜡组织块，或取新鲜组织用石蜡包埋。

注意事项：
1.样本处理和运输过程需要再低温环境。
2.如果样本充足，最好准备2份及以上，一份用于RNA质控和后续的正式切片实验；一份留作备用；
3.如果组织样本珍贵稀缺，可以酌情减少样本数量。

1. 单细胞测序样本：外周血样本｛3+2（CBL）vs 8(NP-BL)｝、鼻内组织样本｛4（CIT4）vs 8（NP）｝
2. Visium样本：CIT vs NP =2 vs 3
3. Visium HD样本：CIT vs NP =4 vs 6
单细胞捕获平台：10 × Genomics
主要技术手段：
单细胞转录组（scRNA-seq）测序、T细胞受体测序（scTCR-seq）、空间转录组学ST(Visium / Visium HD)、免疫荧光（IF）等
NovelBarin云平台分析：
细胞聚类分析，拟时序分析，Pathway分析，细胞通讯分析等

以前对CRS患者患病鼻部组织的单细胞转录组分析研究已经向我们揭示了上皮干细胞、CD38hi CD27hi肥大细胞、ALOX15+巨噬细胞和Th2细胞对Ⅱ型炎症过程发病机制的贡献，而T细胞被确定为NPs中的主要淋巴细胞亚群。该研究工作整合了多种测序技术，包括scRNA-seq、scTCR-seq和ST(Visium / Visium HD)，描述了CD45+淋巴细胞的转录情况，关注了部分CRSwNP鼻粘膜中的CD8+ T细胞及其空间相互作用，并利用多种湿实验及公开的队列数据验证了相应的结果。有助于促进我们对基质免疫细胞信号交互在促进过敏和自身免疫性疾病炎症以及驱动肿瘤发生方面的理解。

该研究首先利用了scRNA-seq数据分析初步确定了研究的方向，UMAP聚类确定了25个不同的簇，同时揭示：

① CD8+ T、ILC2和髓系细胞在鼻腔组织中富集。其中，γδT和NK细胞在CITs中富集，而ILC2s在NPs中富集。

② CRSwNP患者可以根据嗜酸性粒细胞浸润程度分为嗜酸性（E）组和非嗜酸性（NE）组，ILC2s优先富集于E-NPs，B细胞富集于NE-NPs。

③ 患者外周血中免疫细胞组成与对照组相似，提示CRSwNP患者仅为局部免疫应答（后面不再对血液的免疫分析）。

值得注意的是，NPs中GZMK+ CD8+ T细胞增加（该结果通过IF和FLOW进行了湿实验层面的证实），并且这些细胞高表达GZMK和效应记忆T细胞基因特征，但其他颗粒酶低表达，这使它们与其他颗粒酶表达的CD8+ T细胞不同。与之相比，GZMB+ CD8+ T细胞在血液中普遍存在，并且CBL和NP-BL之间、E-BL和NE-BL组之间、E-NP和NE-NP组之间均没有CD8+ T细胞亚型成分没有显著差异。

为了深入探索NPs中的细胞相互作用，该研究对3名患者的NP切片和2名对照参与者的CIT切片进行了10X Visium ST (Visium)分析。然而，该方法获得的基因表达水平低，在特定的T细胞类群中均不显著，因此使用了来自scRNA-seq数据的特征基因生成斑点的富集分数来可视化GZMK+ CD8+ T细胞的分布。

邻域富集分析显示GZMK+ CD8+ T细胞和成纤维细胞之间的共富集有正相关性，意味着这两类细胞之间在物理上有密切的相邻关系。然而，GZMK+ CD8+ T细胞和上皮细胞之间的共富集并不明显。该研究根据特征评分富集模式GZMK+ CD8+ T/成纤维细胞共富集的斑点定义为内斑点，将其周围的斑点定义为中间斑点（间斑点），内斑点和间斑点都表明这两种细胞类型之间的空间接近，而其他斑点表明两种细胞类型之间的距离显著。

由于Visium平台无法实现单细胞分辨率（包含1-10个细胞的55 μm斑点），该研究进一步应用2024年新推出的Visium HD平台（10X Genomics，"Visium HD"）来分析另外4个对照样品和6个NP样品。Visium HD空间基因表达平台提供单细胞规模的空间分辨率，具有2 μm× 2 μm栅格方块，且无间隙。为了平衡细胞分辨率和每个栅格的平均转录本计数以进行分析，在该数据集中使用16 μm × 16 μm的栅格大小进行可视化和分析。对于Visium HD数据集，在集成和无监督聚类之后，使用集成的ScRNA-seq数据集（HRA000772 和 GSE175930）作为参考，进行了基于参考数据的反卷积和细胞注释，使用基于参考数据的反卷积在不同样本中分配统一标签有助于我们分析鼻组织中的空间异质性。

Visium HD数据提供了多种免疫细胞类型和结构细胞的高分辨率图谱，如代表性样品HD_NP4），这些数据不仅验证了之前的单细胞测序数据，更重要的是鉴定并可视化了这些细胞，甚至在固有层中可视化了CD8T_GZMK和CD8T_GZMB两种细胞。

与外周血样本相比，鼻腔组织样本中的克隆扩增更明显，但CITs和NPs中的TCR克隆多样性显著降低，如较低的基于丰度的覆盖率估计量（ACE）、Chao1丰度估计量（Chao）、逆辛普森指数（Inv.Simpson）和Shannon熵分数等。并且不同CD8+ T细胞亚型的克隆扩增程度不同，表现为CD8+ TRM、GZMB+ CD8+ T细胞和GZMK+ CD8+ T细胞在CITs和NPs中都表现出高水平的克隆扩增，并且GZMK+ CD8+ T细胞的克隆扩增在NPs中更明显。

CD8+ T细胞的发育轨迹确定了3条路径，每条路径以CD8+幼稚T细胞开始，随后是CD8+ TRM细胞，路径1以CD8+ MAIT细胞结束，路径2以GZMK+ CD8+ T细胞结束，路径3经过GZMB+ CD8+ T细胞以GNLY+ CD8+ T细胞结束。这些轨迹分析支持GZMK+ CD8+ T细胞和GZMB+ CD8+ T细胞的不同发育路径。

研究将NPs和CITs中CD8+ TRM、GZMK+ CD8+ T细胞和GZMB+ CD8+ T细胞的前10个最丰富的β链CDR3氨基酸序列输入TCR匹配来鉴定抗原表位和相关抗原，结果发现，NPs和CITs中CD8+ TRM和GZMB+ CD8+ T细胞的TCR序列被映射到来自SARS-CoV-2的表位。相比之下，NPs中的几个EBV表位与GZMK+ CD8+ T细胞的CDR3序列相匹配，而CITs中没有表位与GZMK+ CD8+ T细胞的CDR3序列相匹配。

同时该研究利用公用数据集，从Ⅱ型炎症性疾病（特应性皮炎、过敏性哮喘和嗜酸细胞性食管炎）、非Ⅱ型慢性炎症性疾病（慢性阻塞性肺疾病和腺性膀胱炎）、自身免疫性疾病（皮肤红斑狼疮和甲状腺炎）和感染性疾病（败血症和乙型肝炎病毒HBV感染）的scRNA-seq数据中收集了108,969个CD8+ T细胞。

* scRNA-seq展示了NPs组织内GZMK+ CD8+ T细胞的富集，表现出特殊的促炎但低细胞毒性特征，与GZMB+ CD8+ T细胞明显不同，并且GZMK+和GZMB+两个亚群在分化轨迹和识别不同病毒表位的克隆特异性方面不同。
* scRNA-seq与scTCR-seq表征了GZMK+ CD8+ T细胞（非GZMB+的T细胞）在状态表征上非常接近NPs内的成纤维细胞，并激活成纤维细胞以获得促进中性粒细胞炎症的潜力。
* ST（Visium / Visium HD）展示了，GZMK+ CD8+ T细胞-成纤维细胞的在空间定位与信号交互在广泛的炎症性疾病中也很明显。

原文链接：https://doi.org/10.1038/s41467-024-54685-1