中南大学湘雅医院范学工教授课题组通过高通量测序手段，对表达HBx基因的肝细胞中miRNA-mRNA之间的相互调控进行研究，研究成果发表于World Journal of Gastroenterology，烈冰在该工作中提供了高通量测序和生物信息分析服务及技术支持。

肝细胞癌（Hepatocellular Carcinoma, HCC）是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，俗称“癌中之王”。据统计，每年有超过74.5万的患者因HCC死亡，对其发病机制、诊断方法和治疗手段的研究更是如火如荼[1,2]。流行病学调查表明，长期慢性乙型肝炎病毒（Hepatitis B Virus, HBV）感染是导致HCC的主要病因，这种情况在亚洲更为常见[3]。近年来研究发现乙型肝炎病毒X基因（Hepatitis B Virus X, HBx）在HBV相关HCC的发生发展中发挥重要的作用，肝细胞中HBx基因的表达会导致细胞增殖、细胞信号转导、蛋白降解及凋亡[4-9]，但具体的分子机制尚有待阐明。miRNA作为一类内源性小分子RNA，参与基因表达、细胞增殖、分化、凋亡等多种生物学过程。已有研究表明有多个miRNA家族，例如miR-122、miR-125、miR-199等，与HBV相关HCC的发生密切相关[10]。

本篇文章以“Integrated analysis of microRNA and mRNA expression profiles in HBx-expressing hepatic cells”为题发表于 World Journal of Gastroenterology杂志，研究团队来自中南大学湘雅医院范学工教授课题组，NovelBio在该工作中提供了高通量测序和生物信息分析服务及技术支持。该研究对转染HBx基因的肝细胞进行了转录组测序（RNA-Seq）和miRNA测序（miRNA-Seq），并通过对测序数据的分析绘制了miRNA-mRNA核心调控网络，为HBV相关HCC的分子机制研究提供了新的思路和研究靶点。

Methods

研究者建立了可稳定表达HBx基因的人类肝脏细胞系L02，命名为L02/HBx，作为实验组；以转染了空白质粒的L02/pcDNA作为对照组，分别进行mRNA-Seq和miRNA-Seq，筛选出L02/HBx组中发生差异表达的mRNA和miRNA。之后借助GO分析和KEGG Pathway富集分析来评估候选分子标志物（Biomarker）的功能，并通过调控网络图的构建分析差异miRNA和mRNA的相互作用关系。

分析思路

Results

差异基因表达谱分析

首先，研究者通过比较两组细胞的转录组测序数据，在L02/HBx细胞中筛选出1243个差异表达的基因，其中742个基因表达上调，另外501个基因表达下调（Figure1A）。研究者接着分别对这两组基因中上调和下调差异较显著的20个基因做了聚类分析（Figure1B）。

Figure1A. L02/HBx和L02/pcDNA细胞的RNA-Seq整体差异基因表达谱

Figure1B. 差异较显著的20个上调基因和20个下调基因

从这些差异基因中，研究者进一步锁定了5个上调基因---GPR6、KLHL31、FOXC1、UGT1A7 和MAGEA4，以及4个下调基因---SLC22A14、PCOLCE、A2M和KIAA1522，这些差异基因分别参与了DNA复制、细胞周期、细胞增殖、细胞粘附、代谢进程、肿瘤转化等信号通路。研究者通过qPCR对这9个候选基因的表达进行定量验证，定量结果与测序结果完全一致（Figure1C, D）。

Figure1C. 候选差异基因的qPCR验证

Figure1D. 测序结果与qPCR定量结果的相关性分析

GO/KEGG Pathway富集分析

为了阐明差异表达的基因与HBx相关HCC的发生发展的相关性，NovelBio团队协助研究者对1243个差异基因进行了GO功能富集分析和KEGG Pathway富集分析（Figure2A，B）。

Figure2A.差异基因的GO功能富集分析

Figure2B.差异基因的KEGG Pathway富集分析

miRNA表达分析

完成对差异基因的分析之后，文章接着对miRNA的表达进行差异筛选。结果显示，与L02/pcDNA细胞相比，L02/HBx细胞中6个miRNA表达发生下调，16个miRNA表达上调（Figure3）。研究者对其中4个差异miRNA进行 qPCR表达量验证，验证结果与测序结果一致。

Figure3. L02/HBx细胞与L02/pcDNA细胞之间发生差异表达的miRNA

miRNA和mRNA表达谱整合分析

考虑到通过网络图锁定核心miRNA群具有较高的预测准确度，研究者采用以下策略对L02/HBx细胞进行miRNA-mRNA调控网络的构建（Figure4A）。

Figure4A. miRNA-mRNA调控网络构建策略

通过专业miRNA分析软件miRnada和TargetScan，NovelBio团队协助研究者成功预测出miRNA的潜在靶基因，然后结合靶基因群的表达模式（Figure1A），锁定一系列显著相关的miRNA-mRNA靶向关系。从这些关系中，研究者根据Degree值挑选出11个处于核心地位的miRNA，并绘制了miRNA-mRNA靶向调控网络（Figure4B）。该网络图中，与miR340-5p形成靶向关系的基因数目最多，另外有几个miRNA可通过组合的方式共同调控某些靶基因。

Figure4B. miRNA靶向调控网络图

为进一步缩小范围，锁定核心miRNA，研究者对这些靶基因进行了功能富集分析，挑选出其中与肿瘤信号通路（譬如DNA复制、基因表达、细胞周期、细胞分裂等）密切相关的基因，绘制核心miRNA-mRNA调控网络（Figure4C）。由该图可以推测，L02/HBx细胞中发生上调的miRNA，如hsa-miR-7-5p和hsa-miR-182-5p，可能抑制了其靶基因MEF2C和GLI3的表达，从而促进了细胞的转化；而L02/HBx细胞中发生下调的miRNA，包括hsa-miR-501-5p、hsa-miR-340-5p、hsa-miR-324-5p和hsa-miR-488-3p等，则由于表达量的降低减弱了对靶基因（如JAK1、MAPK1、STX3、BCL10等）的抑制效应，这些基因的激活可能会在HBx相关HCC的发生发展中发挥一定的促进作用。

Figure4C. 核心miRNA靶向调控网络图

肝癌的发生是一个多因素、多步骤的复杂生物学过程，涉及一系列的基因和细胞因子，而miRNA参与的基因调控可能在其中发挥了关键作用。在该篇研究之前已有研究报道多个miRNA，譬如hsa-miR-338-3p和hsa-miR-29c等，与HBx相关HCC的发展密切相关[11]。但鲜少有研究者将视线聚焦到miRNA和mRNA之间的靶向调控和相互作用。该研究借助二代测序手段，结合深入的生物信息学分析，首次对相关miRNA和mRNA进行了整合分析，绘制了miRNA-mRNA核心调控网络。此项研究成果不仅有望揭示HCC细胞中HBx蛋白诱导细胞恶性转化的分子机制，还为其临床诊断和治疗提供了有价值的诊断标志物和药物靶点。

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参考文献

1. Jemal A, et al. CA Cancer J Clin 2011; 61: 69-90

2. Ma L, et al. Oncotarget 2015; 6: 25390-25401

3. Okuda K. J Hepatol 2000; 32: 225-237

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5. Shi L, et al. Virus Res 2016; 223: 131-139

6. Murakami S. J Gastroenterol 2001; 36: 651-660

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9. Ma NF, et al. Clin Cancer Res 2008; 14: 5061-5068

10. Meng F, et al. Gastroenterology 2007; 133: 647-658

11. Lamontagne J, et al. World J Gastroenterol 2015; 21: 7375-7399