单细胞转录组联合蛋白组技术共同探索单细胞研究的奥秘

      高通量测序能够检测大量RNA靶点，极大地促进了我们对复杂生物系统的了解。然而，若要进一步探究基因调控和单细胞异质性，可选择同时获取有关RNA和蛋白表达的信息，从多维度进行深入研究。

细胞表面蛋白检测原理：

      BD AbSeq使用寡核苷酸偶联抗体（Ab-oligos）从高通量测序数据中检测蛋白表达。BD AbSeq中的每个抗体克隆都被偶联到一个包含抗体特异性条形码（ABC）的特定寡核苷酸上，与 ABC相邻的是3'端的poly（A）序列以及5'端通用PCR扩增序列。使用二代测序技术对 ABC进行解码，进而检测蛋白丰度。结合使用BD AbSeq与单细胞分析系统，可同时检测样本中的mRNA和蛋白表达。

BD AbSeq 抗体具备高特异性：

     BD AbSeq抗体具备高特异性。高特异性、低背景是评估抗体的重要指标，BD Abseq产品在研发阶段经过滴定，已确认最佳抗体浓度及使用标准，能够确保抗体最佳的特异性（识别到对应的抗原）和低背景（结合到目标细胞以外的细胞上）。

一、多组学分析提供更明确的聚类

     为了探究BD AbSeq提供的蛋白数据能否实现更明确的细胞类型鉴定，研究人员比较了仅用mRNA数据和同时结合mRNA与蛋白的多组学数据对外周血单核细胞 (PBMC)进行分析。

       基于mRNA的分析显示了不同的细胞群：单核细胞和淋巴细胞（B细胞、T细胞和NK细胞）（图A），但CD3+群体中的亚群难以区分（图C）。而多组学数据下的所有细胞类型之间（图B）及CD3+群体内部（图 D）的细胞分群都更清晰。

      由此可见，多组学数据能更好地识别复杂样本中的不同细胞亚群。细胞分辨率的提高，对于在健康或疾病模型中定义新细胞亚群的实验至关重要。

二、检测相应低丰度mRNA的蛋白靶点

      为了确定BD AbSeq数据能否在mRNA和蛋白表达不一致的情况下提供更明确的信息，研究人员比较了CD4和γδTCR受体的mRNA和蛋白数据，这两种受体都是蛋白水平上用于定义不同细胞类型的靶点。

      对CD4 mRNA的检测表明，其在单核细胞及CD4+T细胞中都有表达。然而，使用BD AbSeq数据分析CD4蛋白水平时发现，其只在CD4+T细胞中特异性高表达。

      同样，对δTCR mRNA的检测表明，其在NK细胞和γδT细胞中都有表达。而γδTCR蛋白表达的结果显示，其仅在γδT细胞群中特异性高表达。这些结果表明，当mRNA与蛋白表达不一致的情况下，蛋白数据可定义更精确的细胞亚群。

      为了进一步分析当mRNA 因表达量低而难以检测到的情况下，BD AbSeq能否识别PD1不同表达水平的细胞，研究人员检测了 PBMC群体中PD1的mRNA和蛋白表达水平。结果显示，PD1 mRNA因表达水平低而无法检测到，而BD AbSeq数据显示PD1蛋白在特定细胞类型中表达较高。

      以上结果表明，当mRNA表达量较低时，BD AbSeq能够在蛋白水平上识别高表达因子和低表达因子。对于以PD1等细胞表面分子靶向药物传递的检测，基于蛋白表达来识别和研究细胞对分析药物反应至关重要。 

三、识别新的差异表达基因

      单细胞测序技术可用于检测mRNA的表达，但很难检测不同的亚型。例如，CD45在5'端剪接产生CD45RA和CD45RO（初始淋巴细胞和记忆淋巴细胞的标记物），单细胞测序技术并不能对这些亚型进行区分，而众所周知的抗CD45RA及抗CD45RO抗体能够区分初始和记忆T细胞亚群。为了探究BD AbSeq能否区分这些亚群，研究人员检测了PBMC群体中CD45RA和CD45RO的表达。

      多组学t-SNE结果显示了两个不同的CD4+ T细胞亚群，进一步检测其CD45RA和CD45RO表达，结果显示，这两个不同的亚型分别是：

CD4+CD45RA+CD45RO-

CD4+CD45RA-CD45RO+

      综上所述，通过多组学分析，可以在异质细胞群中进行全面的基因表达分析和生物标记物发掘。

总结：

      BD AbSeq可以在单细胞水平同时检测蛋白和RNA的表达，增强细胞表型分辨率，同时验证和补充RNA数据，更全面地反映细胞状态。单细胞多组学超越了传统的整体分析，能够同时解析特殊细胞群的各组学层面信息。

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