大家好！又见面啦！我是你们的烈小冰，今天给大家带来一篇干货中的干货，讲讲单细胞测序中至关重要的一步——单细胞的分离。

上次跟大家聊的细胞消化悬浮方案反响不错，各位老师都比较认可，销售部同事订单增加不少，BOSS也给加了鸡腿。今天烈小冰再次请到了平时神龙见首不见尾的烈冰实验团队ACE Mr.Wang跟大家再深入地多聊一些实验技术的具体操作问题。

上一回我们按照研究方向进行了分类和举例，今天我们更细致一点，Mr.Wang以亲自上手做过的一些样品为例，按照不同组织/细胞类型进行实验技巧分享。

1. 肝脏：研究领域为肝癌、肝炎及消化性肝脏疾病，代表性物种为人、大/小鼠等。

肝脏可能是目前单细胞测序领域的一个重要分支，毕竟我国乙肝、丙肝及相应肝癌的患者数量确实太多了。无论是SCI文章还是中文核心期刊文章，大多数protocol都是很相似的，100-200 IU/ml的II型胶原酶，剪碎成小块（1-2 mm³），37℃水浴消化30 min-4 h。根据自己实测的人肝癌和小鼠肝脏样品结果来看，肝组织都很大，20 min的消化时间，就能拿到足够多的单细胞了，毕竟细胞数量能够达到10^5级别即可（What!不是说上机1万个细胞么？不要着急，后文在注意事项中会解释具体原因）。Moreover，也有一些课题组应用II+IV型胶原酶的混合液对肝脏组织进行两次灌注：i）第一次灌注，37℃预热的D-hanks`液，从门静脉进入冲洗肝组织内部的血液；ii）第二次灌注，II+IV型胶原酶，门静脉进入，通过流动的消化液逐步“侵蚀”肝脏内部血管内皮以及肝细胞之间的细胞连接，使组织块松散。后续使用组织剪和镊子进行物理撕裂分离，过70 um细胞筛。需要注意的是，整个灌注过程需要高压注射泵来保持恒定的速度，而且，本方法一般适用于动物原代肝细胞的分离，对于已经切除的肝癌组织，灌注法不太适用。

注意！红细胞裂解液！红细胞裂解液！红细胞裂解液！请实验人员务必提前准备好新买的、质量好的红细胞裂解液！鉴于肝脏的解剖学和功能特性，其内部含有大量的血液；而红细胞对测序结果有一定影响，裂红这一部分必不可少。因此，要注意的是裂红试剂最好新买，根据离心后细胞团中红色细胞的含量/比例尽量一次处理完毕，不要裂红两次（细胞活性影响大），裂红时间能短就不要长（一般不超过5 min）。信了说明书的邪，37℃裂红5 min，操作2次，细胞活性下降很多。

2. 脾脏：研究领域为免疫相关研究，代表性物种为大/小鼠。

脾脏作为最大的外周免疫器官，其内部含有大量的淋巴细胞和巨噬细胞，是进行病原感染及基础免疫学研究最常用的器官，也是我最喜欢的组织之二（另一个是肾脏）。操作方面满满的优点，无论是剪碎后IV型胶原酶的消化（仍然是100-200 IU/ml，37℃，20-30 min），还是直接暴力研磨，都能拿到很多很好的单细胞悬液。用东北话讲，抗霍霍。提醒一点，把脾脏离体后，立刻用铜网研磨，边研磨边加入完全RPMI-1640培养液（10% FBS），保证研磨过程中，单细胞会及时被培养液冲洗过铜网，而细胞团块以及一些成纤维细胞、血管内皮等不能通过铜网，铜网直径一般是50-70 um，请自行换算成目数。

3. 肾脏：研究领域为内分泌、外周免疫损伤、肾炎等，代表性物种为人、大/小鼠病例模型。

由于肾脏外存在一层相对致密的膜，且解剖学结构很复杂（内部有皮质髓质肾盂肾盏，外部还有一些腺体），制备单细胞悬液的时候，务必要用手术剪或者刀片把组织切得很碎，这样后续消化得到的细胞中，对应各解剖结构的细胞类型才足够丰富。当然，也跟一些老师交流过，初步剪碎后，通过暴力研磨也可以拿到足够好的细胞（也很抗霍霍），后续可以试试。我们亲测的结果，IV型胶原酶常规消化流程，可以拿到10^7级别且活性相当高的单细胞悬液，很高效。

4. 外周血来源的单细胞：研究领域为基础免疫学、免疫相关疾病、内分泌相关疾病等，代表物种为人或者转基因小鼠。

这部分实验，需要先区别2个名词：白细胞和外周血单个核细胞（PBMCs）。血液通过EDTA管子（不能用肝素管！！！）抗凝后，直接裂红处理，得到的细胞沉淀是白细胞；用淋巴细胞分离液得到的中间云雾层，是PBMCs。主要的差别在于白细胞包含嗜酸/嗜碱/中性粒等细胞，而PBMCs没有。

随后，我们可以开始实验了。无论是直接裂红，还是密度离心，拿到目的细胞群后，一般都是素质三连（离心---弃上清---洗液重悬），然后计数+计活性，最后混匀稀释到一定数量后上机铺板。整个流程是最简单易行的了。

延伸一些，如果老师们的研究目的细胞群体是某一个亚群的细胞，比如造血干细胞，势必会用几种颜色的直标抗体进行FACS分选。这里会衍生出2个实际会遇到的难题：i）目的细胞数量太少，达不到10^5级别；ii）FACS分选后，细胞活性也可能不太好。

针对i）数量少的问题，如果原始来源的细胞量足够，可以通过多批次磁珠富集的方法，收集足够多的细胞，比如肝脏内部的巨噬细胞（Kupffer细胞）在组织内含量很低，直接分离可能数量太少，建议通过磁珠富集的方法进行。又或者Treg细胞，正常状态下，仅占PMBSs总量的1%左右。乖乖用磁珠富集了pool在一起再做后续实验吧。而问题ii），就比较困扰。FACS分选，看似是机器自己操作，但不同的操作人员的操作习惯、实验手法、以及机器配置对细胞活性都有影响。实在无法避免这一步骤的话，请先做预实验，摸索稳定的分选条件。另外，有一点是本人还未想通的。FACS分选时，标记抗体越多，拿到的细胞同质性越高，数量也越少；而问题是，单细胞测序，本身就是要测细胞群体的异质性。拿同质性很高的细胞来做异质性分析，理论上是可行的（万一里面确实有不同的细胞亚群呢，不就发达了么？！CNS不就随便发了么？！），只不过听起来乖乖的，而且数量不够这个问题，一定会影响后续实验。怎么办？个人推测，如果目的细胞群体在总细胞中的含量并不是很低的话，其实可以直接拿总细胞群体去做实验，通过后续的tSNE分析来进行亚群区分以及biomarker分析来确定每一群的marker gene。当然，如果目的细胞亚群数量很少，可能占比10%左右，直接RUN总细胞确实会造成低丰度细胞亚群的细节损失。怎么办？这时就需要灵活一点，少染几个染色的抗体，多pool几个样本做混池，间接提高目的细胞亚群在总细胞内的相对比例。

请注意，以上推测仅仅是为了实验能够顺利进行的一些折中方式，可能在后续分析中会有一定的影响，还没有最终的结论，请勿直接使用。如果造成不必要的损失，也就只能让烈小冰把BOSS给的鸡腿赔给你了。

最后解答一下前面预留的问题：

不是说上机1万个细胞么？怎么又需要提供10^5级别的细胞？

提供的总细胞量与实际上机细胞量，是两个概念。老师提供了总细胞，需要经过几次buffer的素质三连（沉淀—弃上清—重悬），又有可能被裂红，还要过细胞筛去除细胞团块。这一系列操作，会丢失大量的细胞（实验手法的稳定性，在这一步就体现出来了），而且这些丢失无论是用何种平台都是无法避免的。因此，如果最初老师提供的总细胞量低于10^5这个数量级，一系列操作后可能无法满足1万个细胞的上机要求。这时候就只有两个选择：i）直接上机，硬做；ii）通过sample label抗体和其他样品进行pool样混合上机，最后通过数据分析来区分（套路等同于NGS的样品间INDEX）。

好了，今天的单细胞分离实验技术分享就到这里，烈小冰去吃鸡腿了，非常感谢Mr.Wang诚意满满的实战经验分享，我们下期再见！

烈小冰受同事之托，对前几日为烈冰上门做实验的人员提供包宿的同学表达感谢，跟烈冰一起牺牲休息时间完成单细胞实验真的辛苦了！也非常感谢对烈冰的信任，将重要的项目托付给我们，烈冰定不会让你们失望！