空间多组学-单细胞转录组测序-转录组测序公司-上海烈冰生物医药科技有限公司

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什么是空间转录组测序

空间转录组学（Spatial Transcriptomics）是指在组织切片上完成，保留样本空间信息的组学研究。空间转录组可展示组织切片中不同区域的基因表达情况，揭示精细病理区域中激活的信号通路，完成分子特征驱动病理特征的机制解析。空间转录组学完成了病理数字化结合病理影像化的技术革新，对于诊断标志物、耐药位点以及靶向药物的研发，免疫治疗等新兴领域都具有重要作用。

什么是原位分析技术？

烈冰生物亚细胞原位空间组学技术引进10X genomics Xenium平台，将新鲜冷冻（FF）和石蜡包埋（FFPE）组织中的数百种RNA进行表达分析并精确到亚细胞（200纳米）定位，相较 Visium 空间转录组拥有更高的检测精度，将会对我们理解肿瘤微环境、免疫、神经科学、细胞特异性、生物发育等方面产生深远的影响，并进入空间单细胞/亚细胞研究的新时代。

设计原理检测通量空间信息保留实验成本代表性技术

是

空间转录组

Spatial barcode标记空间信息

烈冰的空间转录组技术

较低

高

部分
仅显示切取部位在组织中的空间信息，无细胞内部空间结构

LCM-seq

显微镜下切取待检测组织

LCM-seq、Neo-seq

高

需激光共聚焦显微镜，需经验丰富人员进行显微切割操作

是

FISH-seq

抗体识别，荧光标记

MERFISH、Seq-FISH

高

中

受荧光检测通道限制

针对基因设计探针，需激光共聚焦显微镜，需反复杂交和图像读取

部分
仅显示切取部位在组织中的空间信息，无细胞内部空间结构

流式分选

选取特定细胞，需要特异性抗体对细胞进行分选

FACS, INTACT

较低

高

是

亚细胞|原位分析

基于Padlock探针的多轮荧光检测技术

Xenium in situ

高

中

目前可检测多达400个RNA，未来可检测1000+

基因panel可定制、自动完成荧光探针杂交、成像和解码

Xenium技术原理概览

Visium空间转录组学的原理

当组织冷冻切片附在带有spatial barcode的空间转录组芯片上时，通过透化处理，细胞内的mRNA释放出来，从而被芯片上带有oligo-dT的探针捕获。被捕获的mRNA开始逆转录，得到的cDNA中包含了spatial barcode序列。通过上机测序，可以将每个mRNA转录的序列映射回组织切片中的映射回组织切片中的原始位置。

Visium空间转录组的核心在于芯片部分：

正式文库构建的芯片上有4个捕获区域（6.5mm X 6.5mm，可以检测4个样本）
每个捕获区域含有约5000个被条形码标记的点（barcoded spots）
每个spot直径55μm，每个spot能捕获1-10个细胞
spot与spot中心点之间的距离为100μm
每个spot含有上百万个可以与mRNA结合的捕获探针，每个探针上都带有独特的spatial barcodes，用以标记捕获的mRNA的空间位置

Visium FFPE空间转录组学的原理

在Visium FFPE组织中，样本切片需先和预设的探针（probe）杂交，进一步完成连接反应，再透化释放连接probe与载玻片上的探针结合，从而捕获基因表达信息。

Visium FFPE解决方案针对每一个基因（1.8万个人类基因以及2万个小鼠基因），都预先设计了一对probe以靶定RNA的特定序列
LHS（左端探针）带有read2序列，用以后续PCR扩增；RHS（右端探针）带有polyA序列，用以后续被玻片探针捕获结合
通过probe与组织内RNA杂交，将RNA信息转移到probe上，再将探针两端连接形成完整的DNA链。之后降解杂合RNA链，透化释放连接probe

技术难点和烈冰解决方案

无冷冻切片条件可以进行空间转录组测序吗？

烈冰提供空间转录组全流程服务，包括样本包埋、贴片、选片、HE染色、拍照成像、组织透化、建库测序以及后续的FISH验证等各个步骤，为您提供无忧服务。

冷冻切片质量可否保证？

烈冰搭建了以莱卡CM1950冷冻切片机、尼康多荧光通路全自动扫描显微镜、3Dhistech-midi数字扫描仪为基础的先进实验平台，并制定严格规范的实验室SOP，经过大量的切片、贴片实操演练，对不同类型组织的切片厚度、温度进行优化，确保获得最优质量的冷冻切片。

空间转录组测序数据量大，分析困难怎么办？

利用NovelBrain云分析平台，搭建0代码需求的空间转录组分析流程，准确快速解析空间转录组数据。

空间区域内细胞类型如何判定？

取同一样本组织的相邻区域进行单细胞转录组测序，通过单细胞转录组数据和空间转录组数据的整合分析，判定空间区域内的细胞类别，精确解析组织空间内的异质化信息。

Xenium分析仪每次运行可分析多少个样本?

每次运行时可分析两张Xenium载玻片。每张Xenium载玻片上的可成像区域为10.45× 22.45 mm，其上可放置组织切片，因此每张载玻片上可包含多张组织切片。 06 原位空间组学可以解决的科学问题?

原位空间组学可以解决的科学问题?

亚细胞分辨率可以鉴定细胞间相互作用，挖掘病理状态，了解疾病背后的生物学机制；Xenium原位分析数据与单细胞数据进行直接比较，实现对肿瘤微环境中细胞类型的解析、不同基因表达的分析；

空间多组学的应用领域

病理学

通过添加基因表达维度，得出形态学结论；

通过观察基因表达区域，了解可能发生假阴性/假阳性的位置

肿瘤学

肿瘤微环境及肿瘤异质性，研究空间位置上肿瘤组织与癌旁、正常组织基因表达的区别；

肿瘤发生发展、浸润、转移等不同阶段肿瘤细胞的变化对正常细胞的影响

免疫学

免疫细胞浸润、不同区域的免疫细胞中的基因表达特征；

免疫群体扩散、不同类型免疫细胞的空间位置解析

神经科学

大脑皮层层状组织解析，揭示大脑皮层的结构-功能关系；

正常vs.疾病大脑结构特征分析与疾病相关的基因表达于特定的大脑皮层

发育生物学

通过解析每个发育阶段不同解剖区域特有的基因表达特征，解析组织中与形态形成相关基因；

丰富基因表达的空间注释信息，创建组织发育的空间细胞图谱

空间多组学优势

提供实验操作更精细的冷冻解决方案

- 烈冰配置了LEICA CM1950冷冻切片机，搭配切片经验丰富的实验团队，可以提供一致性更高、实验操作更精细的冷冻切片准备方案

- 保持密切高效的沟通，设计更适合的实验方案，确保每一个实验细节有效进行

高清明场和荧光场拍摄成像解决方案

- 烈冰升级配置尼康相差显微镜和CCD成像系统，更高清分辨率解析组织切片原始图像信息

- 10X,20X,40X,60X更多物镜选择，为不同大小的样本提供更清晰的图像

- 更精细的图像信息采集、拼接策略，为样本内微小区域的组织学提供更清晰的影像

烈冰CytoNavigator云分析平台

- 原拖拽式页面全新升级，真正实现分析0代码，⽣信不求⼈，助力用户挖掘数据背后的生物学意义

- 解决空间转录组测序数据分析中由于超大数据量、超高的质控要求以及繁多分析需求而引起的分析困难

- 做到快速可定制化完成空间转录组分析

提供免疫组化（Immunohistochemistry）和荧光原位杂交（FISH）服务

- 拥有行业先进的3DHISTECH公司的PANNORAMIC系列的数字切片扫描仪，可以同时实现明场与荧光场下冷冻切片的快速扫描成像；

- Z-Stack多层聚焦扫描及Extended Focus 景深扩展多层融合扫描模式，进一步提升分辨率和清晰度，保证切片高分辨的数字图像信息精准采集；

- 能够满足针对分析结果中感兴趣基因的RNA-FISH验证以及组织切片的免疫组化的高清成像，获取表达与定位信息。

定制化一站式服务

- 烈冰生物真正实现空间转录组测序的全程把控，做到从实验设计、空间信息标记、建库测序、定制化分析的全流程一站式服务，助力高分文章发表

- 资深的实验团队保证样本的高度一致性；专业的生物学团队提供个性化的产品应用场景解读、保持对生物学意义的关注；强大的生信分析团队一对一地进行详实科学的实验方案设计并提供多次售后分析

实验流程

样本要求

空间转录组送样

可接受样品类别

冰冻组织:新鲜样本经液氮预冷的异戊烷速冻，-80℃保存
OCT包埋组织:新鲜组织异戊烷速冻后进行OCT包埋，或新鲜组织直接OCT包埋后-80℃速冻,注意标明样本方向，样本于-80℃保存

样本处理和运输过程需要在低温环境

Xenium送样:

新鲜冷冻（FF）样本：新鲜组织OCT包埋后-80℃速冻，可连同包埋模具一同保存运输，在包埋模具上好做方向标记，用于确定切片方向；
石蜡包埋（FFPE）样本：包埋好的石蜡块或石蜡切片3-5张，4℃保存，干燥运输

其它注意事项：

1.可联系烈冰提供Xenium专用玻片，由老师自行贴片，样本处理和运输过程需要在低温环境
2.多样本拼片，需保证同一玻片选择的Panel相同
3.组织大小要长宽小于10.45mm*22.45mm（实际捕获区域大小）
4.切片质检：HE染色质控判断组织形态、空间信息保留是否完好，DV200 > 30%（DV200 为检测样品中大于 200nt 的 RNA 百分比）
5.目前商业化panel仅支持人和小鼠物种（可定制增加100 genes），具有注释良好的转录组的其它物种需要提前定制设计（具体细节请在送样前与我司进行提前沟通）

结果展示

点阵亚群分析

基于每个点阵的基因表达量，采用聚类算法对细胞进行亚群分析，同时采用t-SNE分析对各点阵的空间排布进行可视化展示

解剖区域细分

以每个点阵中的表达量数据为研究对象，根据指定的解剖区域（临近切片或者当前切片）进行结果展示，包括基因区域的集中展示

点阵簇Marker基因分析

可视化展示不同点阵亚群中Marker基因的表达分布：Aldoc星状胶质；GAdl抑制性神经元；Mbp少突胶质细胞；Slc17a6兴奋性神经元

信号通路富集分析

采用个性化分析策略，在研究者关注的点阵、区域、样本中分析研究者关注的基因集

细胞通讯分析

采用Cellphone算法，针对不同点阵亚群cluster之间或内部的Ligand-Receptor关系进行分析，展示了微环境中跨细胞类型的通讯关系，帮助解析微环境的形成机制和调控机理

文献案例

整合空间和单核转录组数据阐明了具有抑郁样行为的雌性食蟹猴的小胶质细胞特异性反应

发表时间：2023 年 7 月

发表期刊：Nature Neuroscience

影响因子：25

发表单位：重庆医科大学附属第一医院

研究背景：根据世界卫生组织（WHO）的数据，自2017年以来，重度抑郁症（MDD）已成为世界上最主要的残疾原因之一，其潜在的细胞和分子机制已有研究者对于男性的MDD基于单细胞分辨率进行初步探索（Corina Nagy, Nat Neurosci, 2020）。

研究方法：单细胞核测序、空间转录组（Visium ST）测序

研究结果：

基于单细胞测序、空间转录组测序等多种技术手段，揭示了细胞类型和皮层特异性基因表达的变化特征。共鉴定出 8个细胞大类，240 个不重复的差异表达基因，这些基因主要富集在胶质细胞；研究者同时采用共表达网络分析锁定了小胶质细胞是低等级抑郁猴中改变的关键细胞群；亚型分析发现了抑郁猴富集的小胶质亚型，将其命名为“抑郁相关小胶质细胞（PIMID）；进一步采用 WGCNA 分析空间组学数据，揭示了抑郁行为、积极以及消极情绪行为模块对于基因在空间分布上的差异，而 PIMID主要定位于猴脑解剖脑的第 6 层，以上成果为抑郁症的靶向干预提供潜在新靶点。

【1】Schwann cells regulate tumor cells and cancer-associated fibroblasts in the pancreatic ductal adenocarcinoma microenvironment

发表时间：202307；发表期刊：Nature Communications；影响因子：16.6；物种：人；组织：胰腺组织

【2】Targeting neoadjuvant chemotherapy-induced metabolic reprogramming in pancreatic cancer promotes anti-tumor immunity and chemo-response

发表时间：202310；发表期刊：Cell Reports Medicine；影响因子：14.3；物种：人；组织：胰腺组织

【3】Single-cell and spatial dissection of precancerous lesions underlying the initiation process of oral squamous cell carcinoma

发表时间：202303；发表期刊：Cell Discovery；影响因子：33.5；物种：人；组织：口腔组织

【4】Integrating spatial and single-nucleus transcriptomic data elucidates microglial-specific responses in female cynomolgus macaques with depressive-like behaviors

发表时间：202307；发表期刊：Nature Neuroscience；影响因子：25；物种：猕猴；组织：脑组织

【5】High resolution mapping of the breast cancer tumor microenvironment using integrated single cell, spatial and in situ analysis of FFPE tissue （单细胞、空转和原位分析（Xenium）联合解析乳腺癌石蜡切片肿瘤微环境）

发表时间：20231219；发表期刊：Nature Communications；物种：人；组织：乳腺癌组织

【6】Decoding spatial organization maps and context-specific landscapes of breast cancer and its microenvironment via high-resolution spatial transcriptomic analysis （高分辨率空间转录组学分析（Xenium）解码乳腺癌和从属微环境的空间组织解构及其成因）

发表时间：20231030；发表期刊：bioRxiv；物种：人；组织：乳腺癌组织

【7】Single cell-resolution in situ sequencing elucidates spatial dynamics of multiple sclerosis lesion and disease evolution （单细胞尺度级别的原位测序（Xenium）揭示了多发性硬化症病变和疾病演变的空间动态）

发表时间：20230630；发表期刊：bioRxiv；物种：小鼠；组织：颈脊髓

【8】Mapping ovarian cancer spatial organization uncovers immune evasion drivers at the genetic, cellular, and tissue level （原位空间组学揭示了卵巢癌的免疫逃逸在基因-细胞-组织水平上的驱动机制）

发表时间：20231019；发表期刊：bioRxiv；物种：人；组织：卵巢癌组织