空间转录组测序-单细胞转录组测序-转录组测序公司-上海烈冰生物

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什么是空间转录组测序

空间转录组学（Spatial Transcriptomics）是指在组织切片上完成，保留样本空间信息的组学研究。空间转录组可展示组织切片中不同区域的基因表达情况，揭示精细病理区域中激活的信号通路，完成分子特征驱动病理特征的机制解析。空间转录组学完成了病理数字化结合病理影像化的技术革新，对于诊断标志物、耐药位点以及靶向药物的研发，免疫治疗等新兴领域都具有重要作用。

设计原理检测通量空间信息保留实验成本代表性技术

是

空间转录组

Spatial barcode标记空间信息

烈冰的空间转录组技术

较低

高

部分
仅显示切取部位在组织中的空间信息，无细胞内部空间结构

LCM-seq

显微镜下切取待检测组织

LCM-seq、Neo-seq

高

需激光共聚焦显微镜，需经验丰富人员进行显微切割操作

是

FISH-seq

抗体识别，荧光标记

MERFISH、Seq-FISH

高

中

受荧光检测通道限制

针对基因设计探针，需激光共聚焦显微镜，需反复杂交和图像读取

部分
仅显示切取部位在组织中的空间信息，无细胞内部空间结构

流式分选

选取特定细胞，需要特异性抗体对细胞进行分选

FACS, INTACT

较低

高

Visium空间转录组学的原理

当组织冷冻切片附在带有spatial barcode的空间转录组芯片上时，通过透化处理，细胞内的mRNA释放出来，从而被芯片上带有oligo-dT的探针捕获。被捕获的mRNA开始逆转录，得到的cDNA中包含了spatial barcode序列。通过上机测序，可以将每个mRNA转录的序列映射回组织切片中的映射回组织切片中的原始位置。

Visium空间转录组的核心在于芯片部分：

正式文库构建的芯片上有4个捕获区域（6.5mm X 6.5mm，可以检测4个样本）
每个捕获区域含有约5000个被条形码标记的点（barcoded spots）
每个spot直径55μm，每个spot能捕获1-10个细胞
spot与spot中心点之间的距离为100μm
每个spot含有上百万个可以与mRNA结合的捕获探针，每个探针上都带有独特的spatial barcodes，用以标记捕获的mRNA的空间位置

Visium FFPE空间转录组学的原理

在Visium FFPE组织中，样本切片需先和预设的探针（probe）杂交，进一步完成连接反应，再透化释放连接probe与载玻片上的探针结合，从而捕获基因表达信息。

Visium FFPE解决方案针对每一个基因（1.8万个人类基因以及2万个小鼠基因），都预先设计了一对probe以靶定RNA的特定序列
LHS（左端探针）带有read2序列，用以后续PCR扩增；RHS（右端探针）带有polyA序列，用以后续被玻片探针捕获结合
通过probe与组织内RNA杂交，将RNA信息转移到probe上，再将探针两端连接形成完整的DNA链。之后降解杂合RNA链，透化释放连接probe

4个

捕获区域

4个

样本

~5000个

条形码标记点

55μm

sport直径

100μm

点距

技术难点和烈冰解决方案

无冷冻切片条件可以进行空间转录组测序吗？

烈冰提供空间转录组全流程服务，包括样本包埋、贴片、选片、HE染色、拍照成像、组织透化、建库测序以及后续的FISH验证等各个步骤，为您提供无忧服务。

冷冻切片质量可否保证？

烈冰搭建了以莱卡CM1950冷冻切片机、尼康多荧光通路全自动扫描显微镜、3Dhistech-midi数字扫描仪为基础的先进实验平台，并制定严格规范的实验室SOP，经过大量的切片、贴片实操演练，对不同类型组织的切片厚度、温度进行优化，确保获得最优质量的冷冻切片。

空间转录组测序数据量大，分析困难怎么办？

利用NovelBrain云分析平台，搭建0代码需求的空间转录组分析流程，准确快速解析空间转录组数据。

空间区域内细胞类型如何判定？

取同一样本组织的相邻区域进行单细胞转录组测序，通过单细胞转录组数据和空间转录组数据的整合分析，判定空间区域内的细胞类别，精确解析组织空间内的异质化信息。

空间转录组测序的应用领域

病理学

通过添加基因表达维度，得出形态学结论；

通过观察基因表达区域，了解可能发生假阴性/假阳性的位置

肿瘤学

肿瘤微环境及肿瘤异质性，研究空间位置上肿瘤组织与癌旁、正常组织基因表达的区别；

肿瘤发生发展、浸润、转移等不同阶段肿瘤细胞的变化对正常细胞的影响

免疫学

免疫细胞浸润、不同区域的免疫细胞中的基因表达特征；

免疫群体扩散、不同类型免疫细胞的空间位置解析

神经科学

大脑皮层层状组织解析，揭示大脑皮层的结构-功能关系；

正常vs.疾病大脑结构特征分析与疾病相关的基因表达于特定的大脑皮层

发育生物学

通过解析每个发育阶段不同解剖区域特有的基因表达特征，解析组织中与形态形成相关基因；

丰富基因表达的空间注释信息，创建组织发育的空间细胞图谱

空间转录组优势

提供实验操作更精细的冷冻解决方案

- 烈冰配置了LEICA CM1950冷冻切片机，搭配切片经验丰富的实验团队，可以提供一致性更高、实验操作更精细的冷冻切片准备方案

- 保持密切高效的沟通，设计更适合的实验方案，确保每一个实验细节有效进行

高清明场和荧光场拍摄成像解决方案

- 烈冰升级配置尼康相差显微镜和CCD成像系统，更高清分辨率解析组织切片原始图像信息

- 10X,20X,40X,60X更多物镜选择，为不同大小的样本提供更清晰的图像

- 更精细的图像信息采集、拼接策略，为样本内微小区域的组织学提供更清晰的影像

烈冰NovelBrain云分析平台

- 解决空间转录组测序数据分析中由于超大数据量、超高的质控要求以及繁多分析需求而引起的分析困难

- 做到快速可定制化完成空间转录组分析

提供免疫组化（Immunohistochemistry）和荧光原位杂交（FISH）服务

- 拥有行业先进的3DHISTECH公司的PANNORAMIC系列的数字切片扫描仪，可以同时实现明场与荧光场下冷冻切片的快速扫描成像；

- Z-Stack多层聚焦扫描及Extended Focus 景深扩展多层融合扫描模式，进一步提升分辨率和清晰度，保证切片高分辨的数字图像信息精准采集；

- 能够满足针对分析结果中感兴趣基因的RNA-FISH验证以及组织切片的免疫组化的高清成像，获取表达与定位信息。

定制化一站式服务

- 烈冰生物真正实现空间转录组测序的全程把控，做到从实验设计、空间信息标记、建库测序、定制化分析的全流程一站式服务，助力高分文章发表

- 资深的实验团队保证样本的高度一致性；专业的生物学团队提供个性化的产品应用场景解读、保持对生物学意义的关注；强大的生信分析团队一对一地进行详实科学的实验方案设计并提供多次售后分析

实验流程

第1步
客户样本

第2步
冷冻切片

第3步
HE染色、拍照成像

第4步
透化、反转

第5步
文库构建

第6步
上机测序

样本要求

数据分析流程

可接受样品类别

冰冻组织:新鲜样本经液氮预冷的异戊烷速冻，-80℃保存
OCT包埋组织:新鲜组织异戊烷速冻后进行OCT包埋，或新鲜组织直接OCT包埋后-80℃速冻,注意标明样本方向，样本于-80℃保存

样本处理和运输过程需要在低温环境

结果展示

点阵亚群分析

基于每个点阵的基因表达量，采用聚类算法对细胞进行亚群分析，同时采用t-SNE分析对各点阵的空间排布进行可视化展示

解剖区域细分

以每个点阵中的表达量数据为研究对象，根据指定的解剖区域（临近切片或者当前切片）进行结果展示，包括基因区域的集中展示

点阵簇Marker基因分析

可视化展示不同点阵亚群中Marker基因的表达分布：Aldoc星状胶质；GAdl抑制性神经元；Mbp少突胶质细胞；Slc17a6兴奋性神经元

信号通路富集分析

采用个性化分析策略，在研究者关注的点阵、区域、样本中分析研究者关注的基因集

细胞通讯分析

采用Cellphone算法，针对不同点阵亚群cluster之间或内部的Ligand-Receptor关系进行分析，展示了微环境中跨细胞类型的通讯关系，帮助解析微环境的形成机制和调控机理

文献案例

空间转录组和单细胞数据整合分析揭示胰腺癌的组织构造

发表时间：2020年1月

发表期刊：Nature Biotechonolgy

影响因子：31.864

发表单位：NYU Langone Health

研究背景：在发育过程或疾病发生过程中，组织内部的不同细胞经历了复杂的生物学过程，因此，组织内部的异质性研究是目前揭示重要生物学研究的一个重要研究手段。组织内部的异质性包括细胞类型的异质性和空间位置的异质性两个层面，细胞类型异质性可由单细胞测序来完美呈现，而空间位置的异质性，则需要可高通量地检测全转录组空间信息的新型研究方法来解决

研究方法：空间转录组测序，获得组织内部精确空间范围内的全基因表达谱，解析空间异质性。

研究结果：

首先将两例新鲜胰腺癌组织同时进行单细胞测序和空间转录组测序分析。以PDAC-A为例，单细胞测序鉴定到15个细胞类群。空间转录组测序获得了以点阵为单位的全转录组信息，根据marker基因的表达情况，将组织切片分为肿瘤区域，胰腺区域，导管上皮区域和基质区域。随后，针对单细胞测序和空间转录组测序得到的特异高表达的基因进行整合分析，得到特定区域的细胞类群组成情况。比如，导管上皮区域主要由导管细胞组成。

对导管细胞细分为四个亚群：缺氧区域导管、腺泡中心导管、尾端导管和抗原递呈导管。并用各个亚群的marker基因与空间转录组数据进行联合分析。发现缺氧导管和尾端导管在肿瘤区域富集。肿瘤组织的缺氧环境可能导致肿瘤区域的导管细胞内缺氧相关基因的表达。

【1】Spatiotemporal dynamics of molecular pathology in amyotrophiclateral sclerosis

发表时间：201904；发表期刊：Science；影响因子：41.037；物种：人、小鼠；组织：腰椎脊髓组织

【2】A Spatiotemporal Organ-Wide Gene Expression and Cell Atlas of the Developing Human Heart

发表时间：201912；发表期刊：Cell；影响因子：36.216；物种：人；组织：胚胎心脏

【3】Repopulating Microglia Promote Brain Repair in an IL-6-Dependent Manner

发表时间：202003；发表期刊：cell；影响因子：36.216；物种：小鼠；组织：大脑小胶质细胞

【4】Integrating microarray-based spatial transcriptomics and single-cell RNA-seq reveals tissue architecture in pancreatic ductal adenocarcinomas

发表时间：202001；发表期刊：Nature Biotechnology；影响因子：31.864；物种：人；组织：胰腺

【5】Combined single-cell and spatial transcriptomics reveal the molecular, cellular and spatial bone marrow niche organization

发表时间：202001；发表期刊：Nature Cell Biology；影响因子：17.428；物种：小鼠；组织：骨髓

【6】Spatially resolved transcriptome profiling in model plant species

发表时间：201705；发表期刊：NaturePlants；影响因子：13.297；物种：模式植物-拟南芥、杨树、云杉；组织：无

【7】Spatial maps of prostate cancer transcriptomes reveal an unexplored landscape of heterogeneity

发表时间：201806；发表期刊：Nature Communication；影响因子：11.878；物种：人；组织：前列腺

【8】Spatially Resolved Transcriptomics Enables Dissection of Genetic Heterogeneity in Stage III Cutaneous Malignant Melanoma

发表时间：201810；发表期刊：Cancer Research；影响因子：8.378；物种：人；组织：皮肤