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什么是单细胞测序

单细胞测序(single cell sequencing)是指在单个细胞水平上,揭示全基因组范围内的所有基因表达情况,包括鉴定组织细胞类型,反映不同样本间的细胞异质性和组织微环境,让您真正了解一块Bulk组织的每一个细胞的真实状态和关联,呈现更加真实和全面的细胞世界。 2013年,单细胞测序技术被《Nature Methods》列为年度技术,同年位居《Science》年度最值得关注的六大领域榜首;2015年再登Science转化医学封面,2018年位居《Science》十大科学突破榜首。目前,单细胞测序技术在肿瘤、发育生物学、微生物学、神经科学、以及植物学等领域发挥重要作用,已经成为生命科学研究的焦点。

烈冰单细胞测序优势

烈冰单细胞测序为了准确快速地进行单细胞测序研究,基于前沿的研究文献进行多重优化,真正做到准确可靠全面的单细胞测序解析

  • 10X Genomics
  • BD Rhapsody
  • PanoCell
  • BD FACSMelody

2016年,10X Genomics公司首次推出ChromiumTM系统,全面对接Illumina测序仪,能够自动化完成大规模单细胞研究。10X Genomics单细胞捕获平台起源自Drop-Seq技术,通过"双十字"微流控系统形成一个个含有细胞和凝胶微珠(gel bead)的油包水的乳滴(GEMs),其核心技术在于凝胶微珠表面的引物序列,由标记细胞的Barcode、标记细胞内mRNA的UMI和捕获mRNA的Poly dT组成。10X Genomics ChromiumTM系统可实现数千乃至数万个单细胞的分析,解决常规scRNA-seq在通量或扩展性方面存在的不足。

BD Rhapsody™单细胞分析系统的诞生基于 BD 在细胞生物学领域 40年的专业技术, 采用CytoSeq特有的蜂窝板技术进行单细胞捕获。该技术用20W+的微孔(该数量级远大于Input细胞数量),保证单孔中的单细胞捕获。同时避免了传统微流控系统中存在的概率碰撞影响捕获效率的问题,采用微孔捕获相对会有更好的捕获效率,保证Input细胞的全面使用。

烈冰“智造计划”于2021年9月,成功突破国外技术垄断壁垒,发布“烈冰智造”第一款,用于单细胞测序的实验耗材——PanoCell双通道微孔芯片!该芯片完美适配BD平台全套原装试剂,磁珠和Protocol,实现国产芯片和国际主流平台的完美结合,为单细胞测序提供高质量、高效率、高性价比的服务方案!

BD FACSMelody 细胞分选仪结合BD高端分选仪技术与智能自动化软件,将简便易用的分选仪推向一个新高度。便捷的操作可帮助节约仪器调试的时间,并且提供质量可重复的检测结果。BD FACSMelody 细胞分选仪让更多的研究者可以使用复杂的流式细胞仪和分选技术获得更想要的细胞,提高实验室效率。

样本要求

样本类型

组织、血液、培养的细胞系、制备好的单细胞悬液
注:若客户样本为组织,且尚未成功将组织样本消化成单细胞悬液,烈冰将尽可能提供技术及实验上的帮助,但因不同类型样本的特异性,无法保证实验方法适用于所有类型组织。

质量要求

细胞活性大于70%,浓度为500-2000细胞/μl,
体积不小于200μl,细胞培养基及缓冲液不能含Ca2+和Mg2+,细胞体积小于40μm。


实验流程

01
客户样本

02
细胞计数及活性
检测

03
单细胞捕获

04
细胞/转录本
标签添加

05
文库构建

06
上机测序

结果示例

细胞数量判断

采用Fastp软件对下机原始数据进行质控,对质控后测序数据中的cell barcode信息及其对应的counts数进行统计,判断测序样本中实际检测到的细胞数量,获得样本的测序细胞数,并根据最终确认的cell barcode信息提取对应的reads。

注:横坐标为细胞数量,纵坐标为每个细胞对应的平均counts数,根据曲线的斜率判断实际检测的细胞数量

基因组比对和表达量统计

以cell barcode对应的reads为研究对象,采用STAR算法将测序数据比对到物种对应的基因组上,获得基因组比对的bam文件。再以bam文件以及基因组注释文件为研究对象,将比对到同一基因上的UMI进行合并,并去除其中重复的UMI序列,得到每个基因的UMI数量,统计每个细胞中检测到的基因数以及转录本数量,并得到表达量矩阵表。

注:左图为细胞中总共检测到的基因数量,右图为去除重复UMI后统计的基因数量

细胞过滤和数据标化

利用基因组比对结果以及表达量结果对测序检测到的细胞进行过滤,去除细胞中基因检测数少、线粒体基因占比大的细胞,统计过滤后的细胞数量并得到对应的表达量矩阵表。采用数据标准化方法(CPM/RLE/UQ/TMM/scran/Downsampling等),对不同样本中细胞基因表达量进行标准化,得到标准化后的表达量矩阵表。

注:横坐标表示每个细胞中UMI的数量,纵坐标表示线粒体基因的占比情况

细胞亚群分析

基于每个细胞中的基因表达量数据,采用聚类算法对细胞进行亚群分析,同时采用t-SNE分析对细胞的分群结果进行可视化展示。同时,还可以对不同样本中各细胞亚群的占比情况进行统计分析。

Chen, et al.Nature Cell Biology,  2021 Jan;23(1):87-98.
注:左图为前列腺肿瘤组织细胞亚群鉴定t-SNE图展示;右图细胞亚群分群情况

Marker基因鉴定

鉴定不同细胞亚群中的Marker基因,并对Marker基因的表达分布进行可视化展示。

Zhang et al., Glia. 2021 Mar;69(3):765-778.
注: marker基因的Feature Plot图和Violin图

差异基因筛选

针对所有或者特定细胞亚群,进行细胞亚群间差异表达基因筛选,获得细胞亚群间差异表达基因。

Zhang, et al. Glia. 2021 Mar;69(3):765-778.
注:该图为不同细胞亚群间差异基因聚类分析Heatmap图

功能分析(GO Analysis)和信号通路分析(Pathway Analysis)

分别采用NCBI/UNIPROT/SWISSPROT/AMIGO等GO数据库,以及KEGG数据库,对Marker基因/差异基因进行功能分析和信号通路分析,从而得到这些基因群体所显著性富集的GO条目和Pathway条目。

Zhang C, et al. J Immunother Cancer 2021;9:e002312.
注:该图为不同cluster之间差异基因显著富集的GO/Pathway条目

SCENIC分析

基于已知的转录因子靶点数据库,以及转录因子和靶基因的表达矩阵,采用SCENIC算法,对于转录因子的调控网络进行计算,得到在每一个细胞中表达的转录因子的调控基因以及调控强度。

Chen, et al. Nature Communication 2020; 11:5077
注:该图为不同cluster之间转录因子调控强度heatmap图

QuSAGE分析

基因集表达激活度定量分析,采用方差膨胀因子(VIF)诊断共线性的方法对于诸如KEGG基因集、GSEA基因集、甚至研究者自己搜集的基因集在Cluster中的富集度进行分析,比较不同Cluster所富集的基因集的差异。

Chen, et al.Nature Cell Biology,  2021 Jan;23(1):87-98.
注:该图为不同cluster之间信号同理调控强度热图

高级数据分析

拟时序分析

以细胞的表达量数据为研究对象,采用TSCAN/monocle/SLICER/Ouija等算法,在虚拟时间轴上对细胞的变化模式进行分析,模拟重建细胞的动态变化过程,获得细胞间的状态转换关系,以及不同状态细胞间差异基因的表达情况。

Chen, et al.Nature Cell Biology,  2021 Jan;23(1):87-98.
注:细胞间状态转换的pesudotime轨迹图(左)、轨迹中细胞占比饼图(左下) 和 Heatmap图(右)

细胞通讯分析

以细胞亚群的基因表达量数据为研究对象,获得细胞中的配体及受体基因的表达信息,采用Cellphone DB算法以及数据库,得到细胞亚群间的信号通讯关系,并计算获得关系的显著性和强度。

Chen, et al. Nature Communication 2020; 11:5077
注:左图:横坐标表示细胞类型,纵坐标表示细胞间通讯配受体关系,圆圈大小表示显著性差异水平,圆圈颜色越红表示细胞间通讯关系越强

TCGA预后联合分析

以TCGA临床信息以及筛选到的关键基因为研究对象,结合TCGA临床数据,进行预后分析,获得该基因/基因集与临床预后之间的关系。

Zhang C, et al. J Immunother Cancer 2021;9:e002312.
注:横坐标表示生存期,纵坐标表示占比,不同颜色曲线代表不同分组