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产品简介

单细胞测序技术(single cell sequencing)是在单个细胞水平上,揭示全基因组范围内的所有基因表达情况,包括鉴定组织细胞类型,反映不同样本间的细胞异质性和组织微环境。

“烈冰智造计划”于2021年9月,成功突破国外技术垄断壁垒,发布“烈冰智造”第一款,用于单细胞测序的实验耗材——PanoCell双通道微孔芯片!该芯片完美适配BD平台全套原装试剂,磁珠和Protocol,实现国产芯片和国际主流平台的完美结合,为单细胞测序提供高质量、高效率、高性价比的服务方案


我们的优势

1. 自主研发PanoCell微孔芯片,搭配BD Rhapsody单细胞平台+BD磁珠+BD全套原装试剂及protocol;
2. 具有丰富的、针对不同样本类型的单细胞悬液制备经验,如:外周血、细胞系、新鲜/冻存器官组织、肿瘤组织,确保细胞活性达到测序要求;
3. 拥有成熟的单细胞测序文库构建技术,一次性完成1000-10000个细胞的文库构建,真正测全组织中所有细胞类型,做到对样本中所有类型细胞的全面解析;
4. 具备完善的单细胞测序和实验质控流程,以及丰富的单细胞测序和数据分析经验,实现个性化、定制化数据分析服务。

样本要求

样本类型:

组织、血液、培养的细胞系、制备好的单细胞悬液

注:若客户样本为组织,且无能力进行组织解离来获取单细胞悬液,烈冰将尽可能提供技术及实验上的帮助,但因不同类型样本的特异性,无法保证实验方法适用于所有类型组织。

质量要求:

1. 细胞活性大于70%

2. 浓度为500-2000细胞/μl

3. 体积不小于200μl

4. 细胞培养基及缓冲液不能含Ca2+和Mg2+

5. 细胞体积小于40μm

实验流程

数据分析流程



结果示例

1、单细胞悬液制备(附加收费项目)
根据研究目的和对象获取新鲜的样本,包括不同类型的肿瘤样本及其对应的正常样本。再根据组织样本的特性,选择合适的消化条件(酶液、消化温度和时间),过筛后获得所需单细胞悬液。

单细胞悬液的制备流程

2、单细胞计数和活性检测
将细胞从培养液体系更换为上样缓冲液体系(Sample Buffer),采用Countstar或BD Rhapsody Scanner能够准确判断细胞数量以及活性状态。(注意:当红细胞/死细胞比例过多时,建议去除此类细胞,保证有效数据量。)

注:活细胞检测明场图(左),绿色荧光(中),红色荧光(右)

3、单细胞捕获
采用BD Rhapsody单细胞捕获平台,将每个细胞及其mRNA标记上对应的标签。将收集的带上磁珠标签的RNA进行反转录,产物可于4℃环境下带回公司进行后续操作。

BD Rhapsody™单细胞分析系统的诞生基于 BD 在细胞生物学领域 40年的专业技术, 采用CytoSeq技术进行单细胞捕获。应用烈冰PanoCell微孔芯片(包含20W+的微孔(该数量级远大于Input细胞数量)),搭配BD平台磁珠+全套试剂+protocol,保证单孔中的单细胞捕获。同时避免了传统微流控系统中存在的概率碰撞影响捕获效率的问题,采用微孔捕获相对会有更好的捕获效率,保证Input细胞的全面使用。

4、高通量测序
PCR扩增后开始进行文库构建,获得每个样本的测序文库。接着采用Illumina Hiseq或NovaSeq高通量测序仪对单细胞转录组文库进行测序,获得每个样本的测序数据。

NovaSeq 6000测序仪

5、细胞数量判断
采用Fastp软件对下机原始数据进行质控,对质控后测序数据中的cell barcode信息及其对应的counts数进行统计,判断测序样本中实际检测到的细胞数量,获得样本的测序细胞数,并根据最终确认的cell barcode信息提取对应的reads。

注:横坐标为细胞数量,纵坐标为每个细胞对应的平均counts数,根据曲线的斜率判断实际检测的细胞数量

6、基因组比对和表达量统计
以cell barcode对应的reads为研究对象,采用STAR算法将测序数据比对到物种对应的基因组上,获得基因组比对的bam文件。再以bam文件以及基因组注释文件为研究对象,将比对到同一基因上的UMI进行合并,并去除其中重复的UMI序列,得到每个基因的UMI数量,统计每个细胞中检测到的基因数以及转录本数量,并得到表达量矩阵表。

注:左图为细胞中总共检测到的基因数量,右图为去除重复UMI后统计的基因数量

7、细胞过滤和数据标化
利用基因组比对结果以及表达量结果对测序检测到的细胞进行过滤,去除细胞中基因检测数少、线粒体基因占比大的细胞,统计过滤后的细胞数量并得到对应的表达量矩阵表。采用数据标准化方法(CPM/RLE/UQ/TMM/scran/Downsampling等),对不同样本中细胞基因表达量进行标准化,得到标准化后的表达量矩阵表。

注:横坐标表示每个细胞中UMI的数量,纵坐标表示线粒体基因的占比情况

8、细胞亚群分析
基于每个细胞中的基因表达量数据,采用聚类算法对细胞进行亚群分析,同时采用t-SNE分析对细胞的分群结果进行可视化展示。同时,还可以对不同样本中各细胞亚群的占比情况进行统计分析。

Chen, et al.Nature Cell Biology,  2021 Jan;23(1):87-98.

注:左图为前列腺肿瘤组织细胞亚群鉴定t-SNE图展示;右图细胞亚群分群情况

9、Marker基因鉴定
鉴定不同细胞亚群中的Marker基因,并对Marker基因的表达分布进行可视化展示


Zhang et al., Glia. 2021 Mar;69(3):765-778.

注: marker基因的Feature Plot图和Violin图



10、差异基因筛选
针对所有或者特定细胞亚群,进行细胞亚群间差异表达基因筛选,获得细胞亚群间差异表达基因。

Zhang, et al. Glia. 2021 Mar;69(3):765-778.

注:该图为不同细胞亚群间差异基因聚类分析Heatmap

11、功能分析(GO Analysis)和信号通路分析(Pathway Analysis)
分别采用NCBI/UNIPROT/SWISSPROT/AMIGO等GO数据库,以及KEGG数据库,对Marker基因/差异基因进行功能分析和信号通路分析,从而得到这些基因群体所显著性富集的GO条目和Pathway条目。

Zhang C, et al. J Immunother Cancer 2021;9:e002312.

注:该图为不同cluster之间差异基因显著富集的GO/Pathway条目

12、SCENIC分析
基于已知的转录因子靶点数据库,以及转录因子和靶基因的表达矩阵,采用SCENIC算法,对于转录因子的调控网络进行计算,得到在每一个细胞中表达的转录因子的调控基因以及调控强度。


Chen, et al. Nature Communication 2020; 11:5077

注:该图为不同cluster之间转录因子调控强度heatmap图


13、QuSAGE分析
基因集表达激活度定量分析,采用方差膨胀因子(VIF)诊断共线性的方法对于诸如KEGG基因集、GSEA基因集、甚至研究者自己搜集的基因集在Cluster中的富集度进行分析,比较不同Cluster所富集的基因集的差异。


Chen, et al.Nature Cell Biology,  2021 Jan;23(1):87-98.

注:该图为不同cluster之间信号同理调控强度热图


高级数据分析
1、拟时序分析
以细胞的表达量数据为研究对象,采用TSCAN/monocle/SLICER/Ouija等算法,在虚拟时间轴上对细胞的变化模式进行分析,模拟重建细胞的动态变化过程,获得细胞间的状态转换关系,以及不同状态细胞间差异基因的表达情况。



Chen, et al.Nature Cell Biology,  2021 Jan;23(1):87-98.

注:细胞间状态转换的pesudotime轨迹图(左)、轨迹中细胞占比饼图 和 Heatmap图(右)



2、细胞通讯分析
以细胞亚群的基因表达量数据为研究对象,获得细胞中的配体及受体基因的表达信息,采用Cellphone DB算法以及数据库,得到细胞亚群间的信号通讯关系,并计算获得关系的显著性和强度。

Chen, et al. Nature Communication 2020; 11:5077

注:左图:横坐标表示细胞类型,纵坐标表示细胞间通讯配受体关系,圆圈大小表示显著性差异水平,圆圈颜色越红表示细胞间通讯关系越强



3、TCGA预后联合分析
以TCGA临床信息以及筛选到的关键基因为研究对象,结合TCGA临床数据,进行预后分析,获得该基因/基因集与临床预后之间的关系。

Zhang C, et al. J Immunother Cancer 2021;9:e002312.

注:横坐标表示生存期,纵坐标表示占比,不同颜色曲线代表不同分组


文献示例

[1] The zinc finger protein Miz1 suppresses liver tumorigenesis by restricting hepatocyte-driven macrophage activation and inflammation[J]. Immunity, 2021.IF=31.745


[2] Huang et al., Multiomics analyses reveal a critical role of selenium in controlling T cell differentiation in Crohn’s disease[J]. Immunity, 2021. IF=31.745


[3] Single cell analysis reveals transcriptomic remodellings in distinct cell types that contribute to human prostate cancer progression[J]. Nature Cell Biology, 202123, 87–98.IF=28.821


[4] Sun H , Wen X , Li H , et al. Single-cell RNA-seq analysis identifies meniscus progenitors and reveals the progression of meniscus degeneration[J]. Annals of the Rheumatic Diseases, 2019, 79(3):annrheumdis-2019-215926.IF=19.101


[5] Multiomics analysis reveals a distinct response mechanism in multiple primary lung adenocarcinoma after neoadjuvant immunotherapy[J]. Journal for ImmunoTherapy of Cancer, 2021;9:e002312.IF=13.751


[6] He Y , Yuan H , Wu C , et al. DISC: a highly scalable and accurate inference of gene expression and structure for single-cell transcriptomes using semi-supervised deep learning[J]. Genome biology, 2020, 21(1). IF=13.584


[7] Zhaohui Chen, Lijie Zhou, et al.Single-cell RNA sequencing highlights the role of inflammatory cancer-associated fibroblasts in bladder urothelial carcinoma[J]. Nature Communications, 2020, 11:5077.IF=14.91


[8] The molecular taxonomy of primate amygdala via single-nucleus RNA-sequencing analysis[J].Science Bulletin, 2020IF=11.78

[9] Intra-heterogeneity in transcription and chemoresistant property of leukemia-initiating cells in murine Setd2−/− acute myeloid leukemia[J].Cancer Communication2021,1-22.IF=10.392


[10] Identification of Monocytes Associated with Severe COVID-19 in the PBMCs of Severely Infected Patients Through Single-Cell Transcriptome Sequencing[J].Engineering, 2021. IF=7.553


[11] Pijuan-Sala B, Griffiths JA, Guibentif C, et al. A single-cell molecular map of mouse gastrulation and early organogenesis[J]. Nature. 2019 Feb;566(7745):490-495.(IF=41.577)


[12] Cao J, Spielmann M, Qiu X, et al. The single-cell transcriptional landscape of mammalian organogenesis[J]. Nature. 2019 Feb;566(7745):496-502.(IF=41.577)