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产品简介

单细胞测序技术（Single Cell Sequencing）是在单个细胞水平上，揭示全基因组范围内的所有基因表达情况，包括鉴定组织细胞类型，反映不同样本间的细胞异质性和组织微环境。

【烈冰智造】于2021年9月发布了第一款用于单细胞测序的实验耗材——PanoCell®双通道微孔芯片；2022年9月推出了灵活度更高、兼容性更好的PanoCell®微孔芯片V2.0版。升级后的V2.0芯片将提供自研蜂巢板+BD平台原装进口单细胞分选试剂+华大T7超高通量测序仪的服务新方案！


我们的优势

1. 自主研发PanoCell微孔芯片，搭配BD Rhapsody单细胞平台+BD磁珠+BD全套原装试剂及protocol；



2. 具有丰富的、针对不同样本类型的单细胞悬液制备经验，如：外周血、细胞系、新鲜/冻存器官组织、肿瘤组织，确保细胞活性达到测序要求；

3. 拥有成熟的单细胞测序文库构建技术，一次性完成1000-10000个细胞的文库构建，真正测全组织中所有细胞类型，做到对样本中所有类型细胞的全面解析；





4.完善的质控流程和数据分析经验：烈冰自研的CytoNavigator 百万级通量数据分析系统确保数据的可靠性和质量，同时能够提供个性化、定制化的数据分析服务，帮助研究人员从海量的单细胞数据中获取有意义的信息。


样本要求

样本类型：


组织、血液、培养的细胞系、制备好的单细胞悬液

注：若客户样本为组织，且无能力进行组织解离来获取单细胞悬液，烈冰将尽可能提供技术及实验上的帮助，但因不同类型样本的特异性，无法保证实验方法适用于所有类型组织。

质量要求：

1. 细胞活性大于70%

2. 浓度为500-2000细胞/μl

3. 体积不小于200μl

4. 细胞培养基及缓冲液不能含Ca2+和Mg2+

5. 细胞体积小于40μm

实验流程

1. 单细胞悬液制备：根据样本特性选择合适的单细胞悬液制备方法，注意红细胞裂解；如若客户样本为已经制备好单细胞悬液，该步骤可以省略；

2. 细胞活性检测：细胞活性需大于70%；

3. 单细胞捕获：通过分选平台（BD）对每个细胞进行捕获；

4. 细胞/转录本标签添加：对结合磁珠标签的RNA进行逆转录引入CB和UMI；

5. 文库构建：对cDNA进行随机引物PCR扩增；

6. 上机测序：烈冰推荐Illumina Hiseq或NovaSeq测序平台，数据量100G/样本。

数据分析流程



结果示例

1、单细胞悬液制备（附加收费项目）
根据研究目的和对象获取新鲜的样本，包括不同类型的肿瘤样本及其对应的正常样本。再根据组织样本的特性，选择合适的消化条件（酶液、消化温度和时间），过筛后获得所需单细胞悬液。

单细胞悬液的制备流程

2、单细胞计数和活性检测
将细胞从培养液体系更换为上样缓冲液体系（Sample Buffer），采用Countstar或BD Rhapsody Scanner能够准确判断细胞数量以及活性状态。（注意：当红细胞/死细胞比例过多时，建议去除此类细胞，保证有效数据量。）

注：活细胞检测明场图（左），绿色荧光（中），红色荧光（右）

3、单细胞捕获
采用BD Rhapsody单细胞捕获平台，将每个细胞及其mRNA标记上对应的标签。将收集的带上磁珠标签的RNA进行反转录，产物可于4℃环境下带回公司进行后续操作。

BD Rhapsody™单细胞分析系统的诞生基于 BD 在细胞生物学领域 40年的专业技术， 采用CytoSeq技术进行单细胞捕获。应用烈冰PanoCell微孔芯片（包含20W+的微孔（该数量级远大于Input细胞数量）），搭配BD平台磁珠+全套试剂+protocol，保证单孔中的单细胞捕获。同时避免了传统微流控系统中存在的概率碰撞影响捕获效率的问题，采用微孔捕获相对会有更好的捕获效率，保证Input细胞的全面使用。

4、高通量测序
PCR扩增后开始进行文库构建，获得每个样本的测序文库。接着采用DNBseq-T7超高通量测序仪对单细胞转录组文库进行测序，获得每个样本的测序数据。

DNBSEQ-T7超高通量测序仪

5、细胞数量判断
采用Fastp软件对下机原始数据进行质控，对质控后测序数据中的cell barcode信息及其对应的counts数进行统计，判断测序样本中实际检测到的细胞数量，获得样本的测序细胞数，并根据最终确认的cell barcode信息提取对应的reads。

注：横坐标为细胞数量，纵坐标为每个细胞对应的平均counts数，根据曲线的斜率判断实际检测的细胞数量

6、基因组比对和表达量统计
以cell barcode对应的reads为研究对象，采用STAR算法将测序数据比对到物种对应的基因组上，获得基因组比对的bam文件。再以bam文件以及基因组注释文件为研究对象，将比对到同一基因上的UMI进行合并，并去除其中重复的UMI序列，得到每个基因的UMI数量，统计每个细胞中检测到的基因数以及转录本数量，并得到表达量矩阵表。

注：左图为细胞中总共检测到的基因数量，右图为去除重复UMI后统计的基因数量

7、细胞过滤和数据标化
利用基因组比对结果以及表达量结果对测序检测到的细胞进行过滤，去除细胞中基因检测数少、线粒体基因占比大的细胞，统计过滤后的细胞数量并得到对应的表达量矩阵表。采用数据标准化方法（CPM/RLE/UQ/TMM/scran/Downsampling等），对不同样本中细胞基因表达量进行标准化，得到标准化后的表达量矩阵表。

注：横坐标表示每个细胞中UMI的数量，纵坐标表示线粒体基因的占比情况

8、细胞亚群分析
基于每个细胞中的基因表达量数据，采用聚类算法对细胞进行亚群分析，同时采用t-SNE分析对细胞的分群结果进行可视化展示。同时，还可以对不同样本中各细胞亚群的占比情况进行统计分析。

Chen, et al.Nature Cell Biology,  2021 Jan;23(1):87-98.

注：左图为前列腺肿瘤组织细胞亚群鉴定t-SNE图展示；右图细胞亚群分群情况

9、Marker基因鉴定
鉴定不同细胞亚群中的Marker基因，并对Marker基因的表达分布进行可视化展示


Zhang et al., Glia. 2021 Mar;69(3):765-778.

注： marker基因的Feature Plot图和Violin图



10、差异基因筛选
针对所有或者特定细胞亚群，进行细胞亚群间差异表达基因筛选，获得细胞亚群间差异表达基因。

Zhang, et al. Glia. 2021 Mar;69(3):765-778.

注：该图为不同细胞亚群间差异基因聚类分析Heatmap图

11、功能分析（GO Analysis）和信号通路分析（Pathway Analysis）
分别采用NCBI/UNIPROT/SWISSPROT/AMIGO等GO数据库，以及KEGG数据库，对Marker基因/差异基因进行功能分析和信号通路分析，从而得到这些基因群体所显著性富集的GO条目和Pathway条目。

Zhang C, et al. J Immunother Cancer 2021;9:e002312.

注：该图为不同cluster之间差异基因显著富集的GO/Pathway条目

12、SCENIC分析
基于已知的转录因子靶点数据库，以及转录因子和靶基因的表达矩阵，采用SCENIC算法，对于转录因子的调控网络进行计算，得到在每一个细胞中表达的转录因子的调控基因以及调控强度。


Chen, et al. Nature Communication 2020; 11:5077

注：该图为不同cluster之间转录因子调控强度heatmap图


13、QuSAGE分析
基因集表达激活度定量分析，采用方差膨胀因子（VIF）诊断共线性的方法对于诸如KEGG基因集、GSEA基因集、甚至研究者自己搜集的基因集在Cluster中的富集度进行分析，比较不同Cluster所富集的基因集的差异。


Chen, et al.Nature Cell Biology,  2021 Jan;23(1):87-98.

注：该图为不同cluster之间信号同理调控强度热图


高级数据分析
1、拟时序分析
以细胞的表达量数据为研究对象，采用TSCAN/monocle/SLICER/Ouija等算法，在虚拟时间轴上对细胞的变化模式进行分析，模拟重建细胞的动态变化过程，获得细胞间的状态转换关系，以及不同状态细胞间差异基因的表达情况。



Chen, et al.Nature Cell Biology,  2021 Jan;23(1):87-98.

注：细胞间状态转换的pesudotime轨迹图（左）、轨迹中细胞占比饼图 和 Heatmap图（右）



2、细胞通讯分析
以细胞亚群的基因表达量数据为研究对象，获得细胞中的配体及受体基因的表达信息，采用Cellphone DB算法以及数据库，得到细胞亚群间的信号通讯关系，并计算获得关系的显著性和强度。

Chen, et al. Nature Communication 2020; 11:5077

注：左图：横坐标表示细胞类型，纵坐标表示细胞间通讯配受体关系，圆圈大小表示显著性差异水平，圆圈颜色越红表示细胞间通讯关系越强



3、TCGA预后联合分析
以TCGA临床信息以及筛选到的关键基因为研究对象，结合TCGA临床数据，进行预后分析，获得该基因/基因集与临床预后之间的关系。

Zhang C, et al. J Immunother Cancer 2021;9:e002312.

注：横坐标表示生存期，纵坐标表示占比，不同颜色曲线代表不同分组


文献示例


[1] CD_99 G1 neutrophils modulate osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells in the pathological process of ankylosing spondylitis.Ann Rheum Dis.2023 Oct；IF=27.4


[2] Immunosuppressive CD10+ALPL+ neutrophils promote resistance to anti-PD-1therapy in HCC by mediating irreversible exhaustion of T cells. Journal of Hepatology. 2023 Aug;IF=25.7


[3] Endothelial response to type I interferon contributes to vasculopathy and fibrosis and predicts disease progression of systemic sclerosis.Arthritis & Rheumatology. 2023 Jul; IF=13.3


[4] Schwann cells regulate tumor cells and cancer-associated fibroblasts in the pancreatic ductal adenocarcinoma microenvironment. Nature Communicationsl. 2023 Jul ; IF=16.6


[5] WT1+ glomerular parietal epithelial progenitors promote renal proximal tubule regeneration after severe acute kidney injury. 2023 Feb; IF=12.4


[6] Single-cell RNA-seq analysis reveals BHLHE40-driven pro-tumour neutrophils with hyperactivated glycolysis in pancreatic tumour microenvironment. GUT. 2022 Jun; IF=24.5