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Visium空间转录组||烈冰生物关键技术——冷冻切片制备

时间:2020-05-25    |    阅读量:10812

        空间转录组(Spatial Transcriptomics)是指保留组织内部精细区域的空间信息的全转录组测序。经过一次实验,即可得到全部基因表达,并可比对至实验过程中H&E染色图像,达到图像化数据和数字化数据的高度整合分析。空间转录组学分析可以精确指示在特定的感兴趣区域内激活了哪些信号通路,发生了怎样的细胞间通讯,完成分子特征驱动病理特征的机制解析。空间转录组以分子方式定义病理,完成了病理影像化至病理数字化结合病理影像化的革新,将在未来的精准医疗研究中发挥举足轻重的作用。

前几期,小编已经简单介绍了Visium空间转录组的原理、实验流程(【空间转录组】第一弹之原理与样本制备,你都了解了吗?),以及高分文章的实验设计和研究思路,从小编分享的这几篇空间转录组的高分文章中,可以看出冷冻切片的制备是整个空间转录组实验的重点,决定了测序数据的质量。为了获得能够指示组织内真实表达水平的切片,实验过程需要在低温环境下快速完成,以确保组织内部RNA稳定性,这也极大考验实验人员的熟练度和专业性!

那我们今天就来说一说冷冻切片需要注意的问题。

1、切片的实验设计

大部分组织样本都远超过芯片捕获区域的面积(6.5mm X 6.5mm),因此,切割区域,切割剖面等实验设计对于样本利用率最大化、成本最低化十分重要。

2、切片的实验设计

大部分组织样本都远超过芯片捕获区域的面积(6.5mm X 6.5mm),因此,切割区域,切割剖面等实验设计对于样本利用率最大化、成本最低化十分重要。

3、冷冻切片厚度

空间转录组是以点阵(spot)为单位记录组织切片的空间信息,芯片上每个spot直径55μm,spot中心点之间距离为100μm,而不同类型的细胞大小差异较大,因此,切片厚度、切片的质量、细胞直径决定了单点捕获的细胞数量,从而影响空间转录组的解析分辨率。

为了获得高质量、完整体现组织中基因表达水平的冷冻切片,烈冰搭建了先进的实验平台,并针对上述技术壁垒,不断地探索练习进行实验操作流程优化。

(一)实验设计

烈冰团队会根据研究方向与应用场景,与客户深度沟通量身设计最适合的实验方案,确保每一个实验细节的有效实行。

  • 对于体积较大的人体肿瘤组织可以分成肿瘤中心、肿瘤边缘、和正常对照等多个切片;疾病组织可以按照不同病变区域的组织形态进行切割。
  • 对于研究发育的课题,组织切片的选取尤其重要。针对不同时间、不同部位的组织采用连续切片或者间隔一定距离进行切片、亦或根据组织形态的差异等不同方式进行切片的选取等因素都需要根据课题的实际情况进行实验设计。
  • 实验过程与客户保持密切沟通,针对切面进行HE染色和拍照,选取最有代表性、包含更多客户感兴趣区域的切片进行后续测序和分析,确保样本组织利用率最大化和最大限度提高实验的性价比。
  • 针对同一组织进行单细胞测序分析,整合空间转录组和单细胞测序分析获得高度一致性实验数据 ,获得更准确的空间层面的细胞分布信息。
  • 同时保留进行空间转录组测序的组织,为客户后期进行FISH验证提供高度一致的样本帮助获得更可靠的实验结果和更有说服力的实验结论。

(二)冷冻切片的质量

烈冰已成功搭建顶级的实验平台,配置了先进的冷冻切片机LEICA CM1950。搭配切片经验丰富的实验团队,为不断优化冷冻切片及产品质量提供硬件和技术保障。

莱卡冷冻切片机:

电动切片、步进马达确保冷冻切片的厚度、质量及切片间一致性;
精细的定位控制可以满足对细微组织的精密切割;
强大的制冷系统为切片温度提供了有力保障

(三)冷冻切片的厚度

冷冻切片厚度应该根据组织类型有所调整,烈冰实验团队亲自操刀实练,对多种组织类型进行测试优化并确定最佳的切片厚度此外,也可以根据样本类别以及客户的个性化需求,具体设定切片厚度,确保获得高质量的组织切片。

(四)冷冻切片的成像

扫描成像可能是影响组织切片原始图像信息精度和准确度的重要因素。烈冰针对空间转录组成像装置——荧光显微镜进行配置升级以避免因切片高倍放大、多视野拍照导致的空间图像缺失。

  • 尼康多荧光通路全自动扫描显微镜,可以实现明场和多种荧光染色成像,适用于各种植物、动物组织染色切片;
  • 配置优良的APO物镜,确保图像边缘具有卓越的分辨率;
  • 搭配电动载物台,精确控制样本的移动路径,获取完整的组织切片成像信息。

五)完善的SOP实验流程

烈冰经过大量实操演练,制定了严谨规范的实验室标准操作流程(SOP)并严格遵守,并根据客户的不同样本不断进行优化,确保前期获得最优样本。

(六) 充足的耗材库存

烈冰的充足耗材库存助力客户样本第一时间完成实验,助力实验快人一步。



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