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上一期小编推出烈冰生物关键技术——冷冻切片制备之后，很多老师都表示很感兴趣，销售部同事订单直线增加。小编整理售前答疑的过程中，发现有老师们对样本准备阶段有很多疑问。那么，本期小编就来详细介绍一下空间转录组（Spatial Transcriptome）样本制备过程的具体问题，提供详细的样本准备指南，助力每一份珍贵的样本都能顺利进行空间转录组实验。
烈冰可接受样本类别：冻存组织，OCT包埋组织。如果样本充足，最好准备2份及以上，一份用于RNA质控和后续的正式切片实验；一份留作备用；如果组织样本珍贵稀缺，可以酌情减少样本数量。
我们请到了烈冰实验团队大神Dr.Han亲自上手，针对小鼠的不同组织进行实验，不断对样本制备操作步骤进行优化， 为老师们实际操作排雷填坑。
空间转录组visium捕获芯片的限制（6.5mmX6.5mm），选择样本前，应先确认好最佳取材位置以及合理组织大小，保证visium芯片的有效利用率。
新鲜组织样本取下后迅速用预冷的PBS溶液或者生理盐水冲洗组织表面残留，然后用干净的吸水纸吸干液体。（此步骤一定要吸干水分，如有液体残留，OCT包埋后，组织表面形成冰晶，影响切片效果）
整个样本处理过程需要保持低温环境（干冰/液氮）
先将装异戊烷的容器放置液氮中预冷15分钟,同时将所有过程中的采集器具进行预冷。
用预冷的样本匙将新鲜组织浸没在异戊烷中.速冻1min或直至组织完全冷冻。
采用异戊烷而不是液氮的原因是液氮的沸点低，组织直接放入液氮后会沸腾，在组织周围产生气穴，导致组织降温过程中不同区域降温不同，改变组织内部形态甚至碎裂，影响组织形态。因此该步骤一定要用异戊烷进行冻存，如果没有异戊烷，可以跳过该步骤，直接将新鲜组织进行OCT包埋后速冻。
在包埋模具中加入一层OCT包埋剂，然后用预冷的镊子迅速将组织放入；
用OCT覆盖组织，使之完全包埋住。确认组织周围没有气泡；立即将其放在干冰上，直至OCT完全冻结。该步骤要保证最终组织周围无气泡产生，气泡的产生会在OCT冷却后在组织周围形成空洞，影响切片效果。
切片厚度一般设定为10μm，但是根据不同的组织类型，切片厚度也会有所调整。例如脂肪含量较高的乳腺组织可能需要更厚的切片。
切片温度一般设定为箱体温度：-20℃，样本头温度：-10℃。不同的组织类型，样品头温度会有所调整，以保证切片的光滑完整性。
切片之前需要将质检合格的冷冻组织和玻片先放入-20℃冷冻切片机箱体中平衡30分钟以上。
烈冰针对不同的组织类型，进行了不同切片厚度、切片温度的尝试与探索，优化出一系列可调整参数。整个切片过程烈冰实验团队会与老师保持密切沟通进行沟通，以保证获取高质量的冷冻切片。
质控I：RIN值检测，RIN值>7进行后续实验，保证组织的RNA完整。
如果送样充足，可以针对组织块进行RNA抽提检验；
如果样本珍贵，也可以在正式冷冻切片前切取一定量的切片进行RNA抽提检测。
为了最大程度减少样本的损失，并保证实验的有效性，烈冰实验团队针对小鼠不同组织，根据组织大小、切片厚度，对20张切片的RNA总量进行统计，对正式实验中质控所需的切片数量起到参考作用，避免造成浪费。
质控II：HE染色成像，保证冷冻切片的空间结构的完整性。前期样本准备实验操作失误会严重影响冷冻切片的空间组织形态。
新鲜组织样本如果表面液体没有吸干，直接进行冻存切片会在组织周围产生冰晶，增加组织脆性，不易切片成功，或者HE染色成像后出现条状裂纹。
OCT包埋如果不注意处理气泡，切片时会出现空洞现象，造成切片不连续，影响切片质量。
冷冻切片时必须保证切片无褶皱、光滑平整，组织无折叠、卷曲。
让我们一起抓住空间转录组的热潮，应在高分文章起跑线，快来联系我们吧。烈冰生物将竭诚为您提供优质的空间转录组测序研究完整的解决方案！
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