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烈冰助力|单细胞测序解析重金属镉Cd对神经的损伤不可逆转

时间：2021-12-13 | 阅读量：2819

环境问题每况愈下：人类生产活动的增加、不规范处理污染物都给环境带来了不小的负担，这其中重金属污染尤为严重。有大量的研究表明长期的镉（Cd）暴露会对神经细胞产生毒性，但这其中机制尚不清楚。

针对重金属对细胞神经毒性的研究，烈小冰客户——复旦大学公共卫生学院常秀丽副教授课题组在Food and Chemical Toxicology(IF=6.023)上发表了题为“Single-cell RNA sequencing of mouse neural stem cell differentiation reveals adverse effects of cadmium on neurogenesis”的文章，从单细胞水平上揭示镉（Cd）对神经干细胞（NSCs）的分化具有毒性作用。

烈冰Novelbio参与本研究中的单细胞测序工作，下面我们一起了解一下本文的研究思路和数据分析过程。

一、样本信息

样本处理：原代的小鼠神经干细胞（mNSCs）从C57BL/6小鼠中获得，而后利用细胞培养（Cd处理或未处理）获得P2代mNSCs细胞。

样本分组：CdCl₂（+）：CdCl₂（-）= 1:1。

单细胞捕获平台：BD Rhapsody 平台

捕获的细胞数：CdCl₂(+)组4826个细胞，CdCl₂(-)组4825个细胞

二、技术手段

单细胞转录组测序 细胞培养技术 细胞活力检测技术 免疫荧光技术

三、单细胞分析工具应用

细胞类型鉴定 subCluster分析 差异基因表达分析 GO/Pathway分析 细胞通讯分析

四、结果分析

1.mNSCs细胞类型鉴定

作者利用单细胞测序技术，分别获得4826个细胞（CdCl₂(+)组）和4825个细胞（CdCl₂(-)组）并划分为14个Cluster。利用Marker Genes判定分析，鉴定出7个主要的细胞类型，包括未成熟神经元(Immature neuron)，星形胶质细胞(Astrocyte)，神经母细胞(Neuroblast)，浦肯野细胞（Purkinje cell），少突胶质前体细胞（OPC），神经干细胞（NSC）和室管膜细胞(Ependymal)（图1）。

图1 细胞类型鉴定及主要细胞亚型鉴定

2.CdCl₂处理影响NSCs的分化

通过细胞亚型的定量分析，作者发现相比于未处理组，CdCl₂处理样本中星形胶质细胞的数量增加了14.4%，未成熟神经元减少了10.1%（图2A）；而后利用免疫荧光技术发现在P2代的mNSC中，超过90%的细胞显示了与分化相关的蛋白（SOX或NESTIN）的阳性表达，表明P2代mNSCs具有多谱系定向分化潜能（图2B）；进一步，研究者发现当用1.5(μM) CdCl2 处理后，GFAP（星形胶质细胞标志物）比例显著增加，DCX（未成熟神经元标记物）比例显著减少，然而当用0.75(μM) CdCl2处理后，只有DCX的比例显著减少（图2C,D）。表明不同浓度CdCl2处理也会影响NSCs的分化能力。

图2 CdCl₂处理后NSCs的分化历程

3.CdCl₂处理后的不同亚型细胞特异性反应

接着，作者探究了CdCl2处理对细胞特异性反应的影响，通过差异基因表达分析发现，CdCl2的处理显著影响了不同亚型细胞中转录本的表达和差异基因的数量，进一步，通过GO分析发现，虽然Cd处理使得未成熟神经元减少，但与其相关的功能条目显著上升（参与细胞锌离子稳态和铜离子解毒的基因表达上调），而与星形胶质细胞相关的GO条目却显著减少；Pathway分析发现，在多种细胞亚型中，大量的差异表达基因在核糖体通路中显著富集，而ERK/MAPK信号通路并不丰富（图3）。

图3 CdCl₂处理对不同亚型细胞特异性反应

4.CdCl₂处理对细胞通讯的影响

细胞通讯方面，作者利用CellPhoneDB分析，发现当用CdCl2处理后，不同亚型细胞间的通讯减少（图4A)；进一步利用韦恩分析，发现了505对配受体关系只在对照组样本中表达，而CdCl₂处理样本中仅存在49对配受体关系。另外，与未成熟神经元数据联合分析发现，67对配受体关系在两组样本中均有表达，而30个配受体关系对仅在对照组中表达（图4B）。其中与未成熟神经元发育相关的BAF6表达下调，而BAF7表达上调（图4C)。