既往研究发现，EGFR突变型肺腺癌（EGFR-LUAD）的PD-L1表达和肿瘤突变负荷（TMB）都较低，免疫治疗疗效不佳。而针对该疾病的免疫微环境（TME）尚不清楚，这都为EGFR-LUAD的治疗增加了难度。

本期，小编为您带来一篇广东省人民医院肺癌研究所周清教授（通讯作者）和杨蕾博士（第一作者）在Journal for ImmunoTherapy of Cancer杂志（IF=13.751）上发表的文章，题目为“Single-cell transcriptome analysis revealed a suppressive tumor immune microenvironment in EGFR mutant lung adenocarcinoma”。该文章从细胞成分和功能的角度来揭示EGFR突变型肺腺癌的特异性肿瘤微环境（TME），为该疾病的免疫治疗策略提供了新的思路。

烈冰生物参与了本次单细胞测序实验和数据分析工作，下面请跟随小编的步伐，来看看这篇文章的研究思路和结果分析吧~

样本信息

①8名患者的9个LUAD肿瘤样本

EGFR突变（EFGR+）：EGFR未突变（EFGR-）=5：4

其中EGFR-样本共获得18704个细胞，EGFR+获得了22095个细胞。

②公共数据库多原发性肺腺癌新辅助免疫治疗后样本（n=3）数据的联合分析

主要分析方法

细胞聚类分析，差异基因表达分析，拟时序分析，细胞通讯分析，GO Pathway分析，多重荧光免疫组化（mIHC）等

单细胞捕获平台

BD Rhapsody

研究结果解析

基于NovelBrain生信分析平台的分析，将获得的40,799个单细胞确定为8种主要的细胞类型：上皮细胞、成纤维细胞、内皮细胞、单核细胞、T/自然杀伤(NK)细胞、中性粒细胞、B/浆细胞和肥大细胞。此外，细胞注释和占比统计发现，EGFR突变型和野生型样本的细胞类型占比存在显著的差异，其中T/NK细胞在两类肿瘤中的数量和占比相似，EGFR+样本中存在更多的单核细胞、肥大细胞和内皮细胞，而EGFR-组的中性粒细胞和成纤维细胞比例更高。

针对上皮细胞，采用sub-Cluster分析将9067个上皮细胞分为13个亚群，进一步采用inferCNV分析将其分为恶性上皮和非恶性上皮两类，而差异基因表达分析发现，CCL18, CXCL1和CXCL3在EGFR+组的恶性上皮细胞中表达水平更高，可能参与巨噬细胞分化和招募Treg细胞；IL-7和IL-8等基因在EGFR-组的表达相对更高，说明相较于EGFR+组，EGFR-的恶性上皮可能更容易促进CD8+T细胞增殖。

此外，研究团队为了验证上皮细胞对于免疫治疗产生的影响，下载了公共数据集中免疫治疗后的单细胞测序样本数据，针对数据的联合分析发现，EGFR+组的上皮细胞与免疫治疗无效样本的上皮特征相似，而EGFR -组与治疗有效样本的上皮特征相似，即EGFR+肺腺癌可能对免疫治疗的反应较差。进一步的上皮细胞拟时序分析表明，EGFR的突变导致了正常上皮细胞分化差异，而beam分析表明，EGFR+组的恶性上皮具有更多与代谢途径相关的基因（如糖酵解、氨基酸代谢等）,可能抑制了CD8+ T在内的T细胞和其他免疫细胞的功能。

对T细胞的细分发现，CD8+组织驻留记忆细胞（CD8+ TRM）和CD8+增殖T细胞（CD8+cycling T）主要存在于EGFR-组中，且检测到CXCL13基因（参与促进三级淋巴结构生成）的表达，而EGFR+组中基本没有表达，说明EGFR+组缺乏CD8+TRM且无法分泌CXCL13促进三级淋巴结构的生成。此外，差异基因表达分析还发现多种免疫检查点（PDCD1、TNFRSF9和ICOS等）在EGFR-组的表达，而EGFR+组中很少但高表达一些免疫抑制因子（CCL4、IL-1β等），以上分析结果也得到了mIHC的验证，说明EGFR突变肺腺癌更难形成对免疫治疗有利的免疫微环境。

此外，研究团队发现CCL2、CCL13、GDF15和CXCL17高表达于EGFR+组中，这些细胞因子多与抑制免疫的微环境相关。相比之下，EGFR-组中的肿瘤相关巨噬细胞（TAM）可能通过表达CXCL9来招募TRM细胞增强肿瘤浸润效果。进一步的细胞通讯分析发现，巨噬细胞是整个细胞通讯网络的关键环节，其中CHIT1_TAM亚群可能在EGFR-组的肿瘤微环境中具有很强的调节能力，以直接和间接地介导TRM的激活和驻留，而在EGFR+肺腺癌中缺失相关的TAMs。相似的，EGFR+组也缺失相关CAF，无法诱导CD8+ T细胞转化为CD8+ TRM细胞，即EGFR突变肺腺癌因缺失TAM和CAF，导致无法招募、驻留和扩展CD8+TRM细胞，进而无法形成三级淋巴结构。

最后，基于CD8+ TRM的重要性，研究团队采用细胞通讯分析发现，CD8+ TRM与成纤维细胞和CHIT1_TAM等细胞存在相互作用，如成纤维细胞通过TGFB2-TGFBR2 和 TGFB3-TGFBR3 配受体的结合，促进了CD8+ T转化为CD8+TRM细胞。此外，与EGFR野生型肺腺癌相比，EGFR突变型肿瘤的T细胞和其他细胞类型之间的多种免疫检查点相关互作通讯显著减少（如PD-1和PD-L1），而缺乏CD8+ TRM很可能是导致其形成肿瘤免疫抑制型微环境的关键因素。

全文总结

研究团队利用单细胞测序联合公共数据分析、多重荧光免疫组化验证等方法，探索了单细胞水平上EGFR突变肺腺癌的免疫微环境景观：多种细胞成分可能通过影响CD8+ TRM抑制了EGFR突变LUAD的特异性肿瘤微环境，即CD8+TRM的缺陷可能是EGFR突变型LUAD抑制性TME的关键因素。这也为EGFR突变肺腺癌的联合免疫治疗提供了新的思路。

原文链接：

http://dx.doi.org/10. 1136/jitc-2021-003534