肿瘤相关巨噬细胞（TAM）为肿瘤相关炎症的重要调节者，主要分为两个亚型，在促进肿瘤细胞增殖侵袭和转移、抑制免疫应答等方面发挥作用。如何诱导TAM重编程成M1促炎型，同时阻止M2抗炎型极化是提高抗肿瘤效果的关键所在。

免疫应答基因1（IRG1）编码乌头酸脱羧酶 (ACOD1), 催化衣康酸(ITA)的产生。ITA及其衍生物能够抑制促炎“M1”巨噬细胞的炎症反应，已经在多种病原体模型中得到证实，但在癌症中却知之甚少。

本研究为基于单细胞测序技术（scRNA-seq），采用小鼠造模，对于编码代谢酶ACOD1的IRG1基因在肿瘤相关巨噬细胞（TAM）重编程和肿瘤微环境重塑(TME)过程中的机制和作用进行了研究，并证实了ACOD1是免疫肿瘤药物的潜在靶点。

烈冰生物合作伙伴——复旦大学生物医学研究院叶丹团队针对上述问题开展了系列研究，于2023年4月在Science Advances （IF=13.600）上发表了题为“ Targeting IRG1 reverses the immunosuppressive function of tumor-associated macrophages and enhances cancer immunotherapy ”的研究论文。复旦大学生物医学研究院叶丹研究员、陈磊蕾副研究员、中国药科大学杨勇教授为共同通讯作者，博士研究生陈雨佳、李冠楠和中国药科大学李娴静为共同第一作者。烈冰生物参与了本研究中的单细胞测序和数据分析工作。

下面小编带你一起了解一下本文的研究思路和数据分析过程。

单细胞测序实验设计

实验分组：黑色素（B16-F10）肿瘤组织；IRG1^+/+ （野生型） n = 3、IRG1^−/− （突变型） n = 3

主要技术手段：单细胞（scRNA-seq）测序、基因敲除构造小鼠模型、流式细胞术、免疫荧光

单细胞捕获平台：BD Rhapsody

NovelBarin云平台分析：细胞聚类分析，差异基因表达分析， Pathway分析 ，基因集富集分析(GSEA)

研究成果解析

一、 基于多种病原体分析Irg1缺乏抑制免疫小鼠肿瘤生长机制

首先，研究团队分析了IRG1在18种肿瘤组织及癌旁组织基因组图谱表达信息，发现IRG1 mRNA在多种肿瘤表达上调，尤其在TAM中高表达，并与部分TAM呈正相关关系。

研究团队采用小鼠骨髓的巨噬细胞 (BMDM)与不同细胞系的肿瘤细胞基于肿瘤细胞条件培养基（TCM）共培养发现，IRG1和衣康酸ITA发生显著性增加。随后基于NF-κB抑制剂处理并观察该信号通路下游IL-6/IL1β表达，证明IRG1与NF-κB信号通路激活存在关联。紧接着，研究者采用IRG1敲除小鼠与非敲除小鼠注射肿瘤细胞系发现，IRG1敲除后的生存时间更长。最后研究者发现，IRG1在黑色素瘤中，淋巴系和非免疫细胞中几乎不表达。

以上结论帮助研究者把研究目标放在了巨噬细胞的IRG1和ITA积累导致的肿瘤细胞变化上，并采用黑色素瘤造模进行后续研究。

二、基于单细胞测序分析IRG1如何影响TAM细胞

为了解IRG1如何影响TAM细胞，并对于整个免疫微环境发挥作用，研究人员采用流式细胞仪分选黑色素瘤样本中的免疫细胞（CD45⁺），并进行单细胞测序。

研究者与烈冰的生信团队一起，从基因数量，线粒体，双细胞等角度对于数据进行质控，以保证后续分析可靠。实验共获得12304个细胞，烈冰分析团队采用单细胞测序分析策略对于黑色瘤样本进行聚类分析（Cluster），得到8种免疫细胞大类，包含19种免疫细胞簇（Cell Cluster）。在这些免疫细胞类群中，IRG1 mRNA表达可以在单核细胞（Adgre1+），巨噬细胞（Itgam+）中被广泛检测，和初期实验得到的结果一致，因此研究者将单核系（单核细胞+巨噬细胞，Monocytic）作为分析重点，进行细分（Sub-Cluster）。

分析团队采用UMAP分析方法将M-Ф和单核细胞群体划分为6个不同的簇，发现IRG1主要在Vcan+单核细胞、促炎巨噬细胞和Vegfa+巨噬细胞3个亚群中表达，三种亚群分别表现出Ly6c2、Spp1和Mrc1高表达。另外，研究者发现Irg1缺失导致小鼠B16-F10肿瘤TME中Vcan+单核细胞和促炎巨噬细胞增加，Vegfa+巨噬细胞减少，IRG1对于肿瘤的促进作用是通过降低促炎巨噬细胞，改变巨噬细胞极化的特征，使得整体免疫环境倾向于抑制炎症带来的。

为验证上述结果，研究团队采用流式细胞仪和免疫荧光分析并证明了IRG1缺失确实是逆转了免疫抑制的肿瘤微环境（TME）进而抑制了肿瘤生长。

三、基于基因差异分析解析IRG1的抗炎作用

烈冰分析团队进一步对于Irg1缺失后富集的细胞类型（Vcan+单核和促炎巨噬细胞）的免疫功能特征进行了讨论，其中发现干扰素刺激基因（Irf7、 Isg15、Ifi44）在Vcan+单核细胞表达上调，抗原呈递和T细胞迁移相关基因（Aif1、TIMD4和TAP1）在促炎巨噬细胞中表现上调并通过实验证明，在Irg1缺失的TAM中，促炎因子以及参与抗原递呈和区划的基因表达上调和免疫抑制因子下调。这些结论再一次支持了，IRG1/ITA是通过巨噬细胞介导免疫抑制，抗原递呈减弱的抑炎肿瘤环境来发挥功能。

另外，研究者建立Transwell系统，采用BMDM与B16-F10肿瘤细胞共培养或B16-F10-TCM处理两种模式，发现IRG1^−/−BMDMs比IRG1^+/+巨噬细胞更有效地促进了T细胞的迁移。与此同时，研究人员还发现CXCR3特异性拮抗剂会通过阻断CXCL9、CXCL10、CXCL11/CXCR3轴，从而阻断T细胞迁移。

四、IRG1影响巨噬细胞促进T细胞趋化的机制

研究者采用失活Tet2^HxD（DNA双加氧酶Tet2双取代突变体）敲入IRG1^-/-和IRG1^+/+的小鼠内进行后续实验发现， IRG1/ITA在TAM亚群中通过抑制DNA双加氧酶Tet2活性，调控炎症基因表达，改变其免疫功能表型。同时，研究者还发现IRG1敲除的小鼠对肿瘤生长有抵抗力，会增强PD-(L)1免疫疗法的疗效。除此之外，单细胞测序结果显示IRG1也在肿瘤相关中性粒细胞(TAN)中表达，研究者针对这一信息进行分析，得出IRG1/ITA在中性粒细胞中并不显著影响肿瘤生长，再次验证了IRG1/ITA是通过巨噬细胞(TME)介导免疫抑制，在肿瘤微环境中发挥功能。

总结

研究团队首次报道ACOD1是TAM重编程的重要调节因子，提出ACOD1为免疫肿瘤药物的潜在靶点，IRG1缺失的巨噬细胞为一种有效的癌症细胞治疗策略，为巨噬细胞靶向干预和提高抗肿瘤治疗效果提供了全新思路。

原文链接：https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.adg0654