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产品简介

基于10X Geomics ChromiumTM动态微流控技术,利用Tn5转座酶酶切开放染色质,形成短片段,单细胞ATAC测序在表观基因组学水平上,揭示单细胞染色质的可及性问题,区分细胞异质性,获得开放染色质的位置、转录因子的结合位点、核小体的调控区域和染色质状态等信息,是单细胞表观遗传学的重要突破。




Alexandro E. Trevino et al. Cell. 2021 Sep


我们的优势

1. 丰富的样本制核经验,细胞核捕获率高达65%

2. 对培养的细胞系、血液、新鲜和冻存组织等样本均可实验(冻存组织限于脑和心脏)

3. 烈冰自主搭建分析云平台,一键实现数据分析,包括peak calling、聚类、TF-motif、细胞亚群、Marker基因和信号通路富集分析等


样本要求

样本类型:

组织、血液、培养的细胞系、制备好的单细胞悬液


质量要求:

1. 细胞活性大于70%

2. 浓度为500-2000细胞/μl

3. 体积不小于200μl

4. 细胞培养基及缓冲液不能含Ca2+Mg2+

5. 细胞体积小于40μm

实验流程

数据分析流程

结果示例

1、原始数据预处理
以原始数据为研究对象,从FASTQs中裁剪adapter序列进行序列比对,统计样本或细胞中每个峰的碎片数量,计算每个细胞的TF z-scores以及确定背景峰值集匹配的GC和峰值强度。



2、Peak Calling
使用MACS2进行Peak Calling。


3、聚类分析
基于ATAC的peak信号,使用对细胞进行聚类分析,然后通过t-SNE进行降维展示样本的细胞分群情况。



4、TF-Motif分析
基于染色质开放位点和转录因子数据库JASPAR关联,对cluster的每个Motif进行注释,获得cluster差异motif并在t-SNE分群图中可视化,同时得到motif的可变性统计、富集性分析和motif聚类分析结果。

Jason D, et al. Cell, 2018; Wenliang Wang et al. PNAS, 2020.


5、Marker基因展示
根据Marker基因在无监督聚类分析得到的各cluster中的表达情况,进行多种类型的结果展示。

Darren A. Cusanovich, et al. Cell, 2018.


6、Peak分析与注释
对Peak在基因组不同功能区域(promoter、5’UTR、3’UTR、 Exon、Intron、Downstream、Intergenic)上的分布进行注释和统计。获得诸如最接近的基因之类的基因组特征列表,并使用GO、KEGG和Reactome等数据库进行功能富集分析。



7、差异Peak分析
以分群结果为研究对象,针对特定亚群,进行亚群间差异Peak筛选,获得亚群间差异表达基因。

Jeffrey M., et al. Nature Biotechnology, 2019.


8、功能分析(GO Analysis)& 信号通路分析(Pathway Analysis)
采用NCBI/UNIPROT/SWISSPROT/ AMIGO等GO数据库,对于基因群体进行功能分析得到该基因群体所显著性富集的功能条目;采用KEGG数据库,对于基因群体进行信号通路分析,得到该基因群体所显著性富集的信号通路条目。



9、QuSAGE
采用了方差膨胀因子算法(Variance Inflation Factor)对于基因集进行类GSEA的富集度分析。获得不同Cluster的不同的基因集诸如KEGG基因集,GSEA基因集,甚至研究者自己搜集的基因集进行富集度分析,比较不同 Cluster的Peak富集度差异。

10、PesudoTime分析
采用monocle2等算法,在虚拟时间轴上对细胞的变化模式进行分析,模拟重建细胞的动态变化过程,获得细胞间的状态转换关系。

Jason D, et al. Cell, 2018.

11、共可及性分析
利用单细胞染色质可及性数据预测基因组中更有可能在细胞核物理上接近的区域,并得到基因组区域顺式结构的整体结构。

12、单细胞ATAC与单细胞转录组测序联合分析
单细胞ATAC测序能够通过检测染色质的开放程度探索顺势调控序列和基因表达调控,与单细胞转录组测序结合可以实现对每种细胞类型的基因调控网络、潜在的染色质结构和关键转录因子的探测。


左图为单细胞RNA-seqATAC-seq数据整合:通过整合单细胞转录组和ATAC数据,确定ATAC细胞类型注释的可靠性与一致性。


右图为Peak和基因关联分析:进行peak与基因的关联分析,能够找到特异的转录因子关联网络。



文献示例

[1] Zhang, T. Q., et al. Single-cell transcriptome atlas and chromatin accessibility landscape reveal differentiation trajectories in the rice root. . 2021. Nature Communications, 12(1).


[2] Conde, D., et al. A robust method of nuclei isolation for single-cell RNA sequencing of solid tissues from the plant genus Populus. 2021. PLoS ONE, 16(5 May), 1–15.


[3] Gohil, S. H., et al. Applying high-dimensional single-cell technologies to the analysis of cancer immunotherapy. 2021. Nature Reviews Clinical Oncology, 18(4), 244–256.


[4] Waldman, B. S., et al. Identification of a Master Regulator of Differentiation in Toxoplasma. 2020. Cell, 180(2), 359-372.e16.


[5] Xu, X., Crow, M., et al. Single-cell RNA sequencing of developing maize ears facilitates functional analysis and trait candidate gene discovery. 2021. Developmental Cell, 56(4), 557-568.e6.


[6] Chen, H., Lareau, C., et al. Assessment of computational methods for the analysis of single-cell ATAC-seq data. 2019. Genome Biology, 20(1), 1–25.


[7] Jia, G., Preussner, J., et al. Single cell RNA-seq and ATAC-seq analysis of cardiac progenitor cell transition states and lineage settlement. Nature Communications, 9(1).