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产品简介

单细胞测序技术(single cell sequencing)是指在单个细胞水平上,对基因组、转录组、表观组进行高通量测序分析的一项新技术,它能够弥补传统高通量测序的局限性,揭示单个细胞的基因结构和基因表达状态,反映细胞间的异质性。

2013年,《Science》将其列为年度最值得关注的六大领域榜首;2015年再次登上Science转化医学封面。2018年跻身Science 年度突破技术; 2019年,单细胞多组学被列为Nature Methods年度技术,2021年,又被评选为10大创新生物科技之一...目前,单细胞测序技术在肿瘤、发育生物学、微生物学、神经科学、以及植物学等领域发挥重要作用,正成为生命科学研究的焦点,具有广阔的应用前景。


单细胞转录组测序流程--点我了解更多

我们的优势

1. 拥有行业认可的10X Genomics和BD Rhapsody单细胞平台,实现真正意义上的单细胞测序;

2. 具有丰富的、针对不同样本类型的单细胞悬液制备经验,如:外周血、细胞系、新鲜/冻存器官组织、肿瘤组织,确保细胞活性达到测序要求;

3. 拥有成熟的单细胞测序文库构建技术,一次性完成1000-10000个细胞的文库构建,真正测全组织中所有细胞类型,做到对样本中所有类型细胞的全面解析;

4. 具备完善的单细胞测序和实验质控流程,以及丰富的单细胞测序和数据分析经验,实现个性化、定制化数据分析服务。

样本要求

样本类型:

组织、血液、培养的细胞系、制备好的单细胞悬液

注:若客户样本为组织,且无能力进行组织解离来获取单细胞悬液,烈冰将尽可能提供技术及实验上的帮助,但因不同类型样本的特异性,无法保证实验方法适用于所有类型组织。

质量要求:

1. 细胞活性大于70%

2. 浓度为500-2000细胞/μl

3. 体积不小于200μl

4. 细胞培养基及缓冲液不能含Ca2+和Mg2+

5. 细胞体积小于40μm

实验流程

数据分析流程


结果示例

1、细胞数量判断
对测序数据中的cell barcode信息及其对应的counts数进行统计,判断测序样本中实际检测到的细胞数量。

注:横坐标为细胞数量,纵坐标为每个细胞对应的平均counts数,根据曲线的斜率判断实际检测的细胞数量



2、基因组比对和表达量统计
将测序数据比对到物种对应的基因组上,获得基因组比对的bam文件。再将比对到同一基因上的UMI进行合并,并去除重复的UMI序列,统计每个细胞中检测到的基因数以及转录本数量,获得表达量矩阵表。

注:左图为细胞中总共检测到的基因数量,右图为去除重复UMI后统计的基因数量



3、细胞过滤和数据标化
利用基因组比对结果以及表达量结果对测序检测到的细胞进行过滤,去除细胞中基因检测数少、线粒体基因占比大的细胞,统计过滤后的细胞数量并得到对应的表达量矩阵表。采用数据标准化方法(CPM/RLE/UQ/TMM/scran/Downsampling等),对不同样本中细胞基因表达量进行标准化,得到标准化后的表达量矩阵表。

注:左图为每个细胞中的线粒体占比——nUMI数量相关性分析图,
右图为单细胞测序中每一个细胞的基因——nUMI数量相关性分析图



4、细胞亚群分析
基于每个细胞中的基因表达量数据,采用聚类算法对细胞进行亚群分析,同时采用t-SNE分析对细胞的分群结果进行可视化展示。同时,还可以对不同样本中各细胞亚群的占比情况进行统计分析。

Chen, et al. Nature Cell Biology, 2021 Jan;23(1):87-98.

注:左图为前列腺肿瘤组织细胞亚群鉴定t-SNE图展示;右图为不同样本中各细胞亚群的占比情况




5、Marker基因鉴定
鉴定不同细胞亚群中的Marker基因,并对Marker基因的表达分布进行可视化展示。

Zhang, et al. Glia, 2021 Mar;69(3):765-778.

注: Marker基因的Feature Plot图和Violin图



6、功能分析(GO Analysis)和信号通路分析(Pathway Analysis)
分别采用NCBI/UNIPROT/SWISSPROT/AMIGO等GO数据库,以及KEGG数据库,对Marker基因/差异基因进行功能分析和信号通路分析,从而得到这些基因群体所显著性富集的GO条目和Pathway条目。

Zhang, et al. Glia, 2021 Mar;69(3):765-778.

Zhang C, et al. J Immunother Cancer, 2021;9:e002312.

Chen, et al. Nature Cell Biology, 2021 Jan;23(1):87-98.

7、SCENIC分析
基于转录因子靶点数据库(或者转录因子Motif数据库),转录因子及其靶基因在目标细胞群体中的表达情况,计算每一个转录因子在细胞中的调控基因以及其调控强度(AUCell Score),找到每一个Cell Cluster的特异性转录因子。

Chen, et al. Nature Communication 2020; 11:5077



8、Qusage分析
基于基因集和基因表达的定量,采用方差膨胀因子算法(Variance Inflation Factor),对于基因集进行类富集度分析得到不同Cluster的不同的基因集(诸如KEGG/GO/GSEA,甚至研究者自己搜集的基因集)进行富集度分析,比较不同Cluster的富集度差异。

Chen, et al. Nature Cell Biology, 2021 Jan;23(1):87-98.


9、Pesudotime分析
以细胞的表达量数据为研究对象,采用TSCAN/monocle/SLICER/Ouija等算法,在虚拟时间轴上对细胞的变化模式进行分析,模拟重建细胞的动态变化过程,获得细胞间的状态转换关系,以及不同状态细胞间差异基因的表达情况。

Chen, et al. Nature Cell Biology, 2021 Jan;23(1):87-98.

Sun, et al. Annals of the Rheumatic Diseases, 2019, 79(3):215926.

注:细胞间状态转换的pesudotime轨迹图(左)和Heatmap图(右)



10、细胞间通讯分析
以细胞亚群的基因表达量数据为研究对象,获得细胞中的配体及受体基因的表达信息,得到细胞亚群间的信号通讯关系。

Chen, et al. Nature Communication, 2020;11:5077.

注:横坐标表示细胞类型,纵坐标表示细胞间通讯关系,圆圈大小表示显著性差异水平,圆圈颜色越红表示细胞间通讯关系越强



11、TCGA预后联合分析
以TCGA临床信息以及筛选到的关键基因为研究对象,结合TCGA临床数据,进行预后分析,获得该基因/基因集与临床预后之间的关系。

Zhang C, et al. J Immunother Cancer, 2021;9:e002312.

注:横坐标表示生存期,纵坐标表示占比,不同颜色曲线代表不同分组



文献示例

[1] A rice single cell transcriptomic atlas defines the developmental trajectories of rice floret and inflorescence meristems,New Phytologist,2022 IF=10.15


[2] Single-cell transcriptome analysis revealed a suppressive tumor immune microenvironment in EGFR mutant lung adenocarcinoma,Journal for ImmunoTherapy of Cancer,2022 13.751


[3] Single cell analysis reveals transcriptomic remodellings in distinct cell types that contribute to human prostate cancer progression,Nature Cell Biology,2021 IF=28.821


[4] Multiomics analysis reveals a distinct response mechanism in multiple primary lung adenocarcinoma after neoadjuvant immunotherapy,Journal for ImmunoTherapy of Cancer,2021  IF=13.751


[5] The zinc finger protein Miz1 suppresses liver tumorigenesis by restricting hepatocyte-driven macrophage activation and inflammation,Immunity,2021 IF=31.745


[6] Intra-heterogeneity in transcription and chemoresistant property of leukemia-initiating cells in murine Setd2−/− acute myeloid leukemia,Cancer Communication,2021   IF=10.392


[7] Multiomics analyses reveal a critical role of selenium in controlling T cell differentiation in Crohn’s disease,Immunity,2021 IF=31.745


[8] Single-cell analysis reveals EP4 as a target for restoring T-cell 1 infiltration and sensitizing prostate cancer to immunotherapy,Clinical Cancer Research,2021 IF=12.53


[9] Pluripotency acquisition in the middle cell layer of callus is required for organ regeneration,Nature Plants,2021 IF=15.79


[10] Single-Cell Transcriptome Profiling Reveals Multicellular Ecosystem of Nucleus Pulposus during Degeneration Progression,Advanced Science,2021 IF=16.802