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号外号外！前列腺癌Nature子刊发文后续，针对免疫疗法对前列腺癌治疗效果差的问题，上海长征医院任善成教授团队应用单细胞测序持续发力，挖掘前列腺癌免疫疗法的重要靶点。
继NCB文章发表研究进展后，2021年11月，任善成教授团队再次于国际权威期刊Clinical Cancer Research（IF=12.53）上，发表前列腺癌免疫治疗的前沿研究性论文——“Single-cell analysis reveals EP4 as a target for restoring T cell infiltration and sensitizing prostate cancer to immunotherapy”。这篇文章主要内容是利用单细胞测序等技术揭示了EP4（PTGER4）作为恢复T细胞浸润和使前列腺癌敏感的靶标。
烈冰生物有幸参与本研究中的单细胞测序和数据分析工作，下面我们一起了解一下本论文的研究思路和数据分析过程吧~
样本信息
样本收集：
13个原发前列腺癌PCa样本（10X Genomics平台）
4个去势性前列腺癌CPRC样本（BD Rhapsody平台）
单细胞捕获平台：10X Genomics、BD Rhapsody
技术手段
单细胞转录组测序
流式细胞分选
细胞培养技术
普通转录组测序
药物治疗模型
细胞趋化因子分析技术
单细胞分析工具应用
标准化主成分分析
细胞类型鉴定
subCluster分析
差异基因表达分析
拟时序分析
接下来，小编将从以下6个方面为大家详细介绍一下这篇文章中的主要研究成果。
结果分析
1.EP4(PTGER4)作为耗竭型T细胞的marker gene
为了研究EP4在T细胞介导的前列腺癌（PCa）免疫中的作用，作者对13个原发PCa患者和4个CRPC患者的癌组织样本进行单细胞测序研究。通过无监督聚类分析，分别利用UMAP进行可视化展示，结果如下图1.1A。
图1.1 原发PCa和CRPC的细胞类型鉴定
对CD8+ T细胞进行拟时序分析发现，原发PCa患者的CD8+ T细胞有两个分化方向，基于拟时序的BEAM（Branch Expression Analysis modeling）分析，发现T细胞向耗竭转化过程中，EP4基因表达显著上升。同样在CRPC患者中，也观察到了这个现象。研究者随后在泛癌（pan-cancer）表达谱数据水平上进一步验证，发现在非小细胞肺癌、肝细胞癌、结肠癌中的耗竭型T细胞中也同时高表达EP4，即EP4可能是耗竭型T细胞的marker gene。进一步，作者利用Changhai，TCGA等数据库的前列腺癌转录组测序数据进行分析，确定了EP4是前列腺癌耗竭型T细胞的基因标记。
图1.2 EP4作为耗竭型T细胞的marker gene的特征
2.EP4的高表达表明免疫抑制微环境的存在
为进一步探究EP4在前列腺肿瘤免疫微环境（TME）中的作用，研究者对TAMs（肿瘤相关的巨噬细胞）和中性粒细胞的数据进行了拟时序分析和差异基因表达分析，发现原发性PCa的TAMs有两个M2的抑制免疫的分化方向(图2A，B)。在CRPC样本中，鉴于BD Rhapsody平台可以无偏的对中性粒细胞进行功能分析，采用该平台鉴定出6个中性粒细胞亚群和2个多态核髓系来源的抑制细胞亚群（PMN-MDSCs， marker为LOX-1）。进一步，使用流式细胞术分选出LOX-1阳性的细胞，并与T细胞共培养，发现PMN-MDSCs抑制了T细胞增殖并降低了细胞毒性。拟时序BEAM分析发现，EP4表达量不同可影响PMN-MDSCs的分化趋势；GSEA分析发现，EP4的高表达可显著改变了白细胞偏移和趋化因子介导的信号通路，表明PMN-MDSC参与免疫微环境调节，而这也通过流式细胞分析中验证了该结论。
图2 EP4作为免疫抑制因子在前列腺癌免疫微环境中的作用
3.EP4拮抗剂（YY001）调节TME中T细胞和MDSCs的功能和浸润
已有研究发现PGE2可诱导EP4表达进而促进PMN-MDSCs的发育成熟，研究团队自主开发了一种小分子药物YY001（EP4特异性的拮抗剂），利用YY001治疗并通过FASC流式细胞分选和免疫荧光分析，发现YY001能逆转PGE2对IFN-γ的抑制作用，其效果与另一种EP4拮抗剂（E7046）相似(图3A)。此外，YY001可促进T细胞的增殖(分化为naïve T和中央记忆T细胞)。在肿瘤细胞中，YY001治疗显著逆转了PGE2诱导MDSC向TME的趋性。作者推测EP4拮抗剂和PD-1免疫治疗联合使用对PCa有较好的抑制作用(图3）。
图3 体内外实验研究YY001的功能
4.YY001与抗PD-1抗体协同抑制PCa
基于先前研究，作者通过EP4拮抗药物和抗PD-1抗体联合用药治疗PCa，发现治疗效果要好于单独使用E7046（图4A）；流式检测显示PD-1可抑制MDSCs的浸润但不增加CD8+ T细胞的浸润；与YY001联合用药后，MDSCs的浸润程度明显减少(图4C和4E)、CD8+ T细胞的浸润显著增加(图4D和4F)，对肿瘤组织中MDSCs和CD8+ T细胞也得出了同样的结论(图4G和4H)，即联合用药下，浸润的CD8+ T细胞被极大地激活，导致杀伤肿瘤的TNF-γ以及IFN-α分泌增加(图4I），削弱了MDSCs的免疫抑制功能，减少了MDSCs的浸润(图4J-L)。
图4 YY001与抗PD-1抗体协同抑制PCa
5.联合治疗缓解前列腺肿瘤细胞的免疫抑制作用
为了进一步评估单独使用YY001或结合PD-1抗体的疗效，作者开发了一个15抗体PFC（多色流式细胞术）的panel，发现小鼠肿瘤样本中可为癌细胞（CD45-）和白细胞（CD45+）两大类，与未治疗组相比，用药组白细胞数量显著增加（图5A），MDSCs细胞的数量减少，联合治疗后的细胞毒性T细胞（CTLs）增加的数量明显多余单独用药（图5B,C）。且用药后出现了自然杀伤细胞群体（图5D），表明YY001与PD-1抗体的联合治疗可引起杀伤肿瘤效应变化。此外，定量免疫荧光技术检测发现，联合治疗后CD8+ T细胞数量增加（图5E），即联合用药可促进肿瘤免疫微环境的形成，增强CD8+ T对肿瘤细胞的杀伤能力。
图5 联合治疗缓解免疫抑制
6.联合治疗可抑制肿瘤生长
在动物模型中，研究者利用CD8拮抗剂阻断CD8+ T细胞作用后，发现YY001单独用药或联合PD-1抗体治疗均抑制了肿瘤的发展（图6A-C）。另外，CD8的阻断不影响粒细胞浸润，但影响了CD8+ CTLs细胞活性（图6D-F），这表明CD8+ CTLs在治疗前列腺癌中的关键作用。
最后作者使用了3种小鼠模型（Orthotopic, Rechallenged, humanized）验证了YY001与抗PD-1抗体联合用药的治疗效果，发现在Orthotopic小鼠模型中，联合用药几乎抑制了肿瘤的发生，模型小鼠存活率达100%；Rechallenged小鼠模型中，联合用药显著抑制肿瘤生长且延长小鼠寿命；Humanized小鼠模型中，联合用药疗效要优于单一治疗，流式验证发现YY001和抗PD-1抗体的联合治疗显著增加了CD45+ T细胞的浸润和CD8细胞数量。以上结果说明YY001联合抗PD-1抗体对前列腺癌的治疗效果显著。
图6 各种前列腺癌模型中联合治疗可抑制肿瘤生长并提高生存率
总结：
本研究应用单细胞测序等技术，全面探索了前列腺肿瘤组织内细胞的基因表达情况，发现EP4作为一个marker gene在前列腺肿瘤和多种免疫细胞中特异性表达。另外，研究者自主开发的新型药物YY001可同时作用于肿瘤细胞和周围的免疫细胞，一举解决“识别”和“清除”两大难题，增强免疫细胞对肿瘤的杀伤作用。YY001与抗PD-1抗体联合用药，可显著增强前列腺肿瘤免疫治疗的疗效，为前列腺肿瘤治疗提供了新的方案。
原文链接
https://doi.org/10.1158/1078-0432.CCR-21-0299
THE END
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