骨折是最常见的骨创伤疾病，其愈合由成骨细胞和破骨细胞共同作用调节。已有研究表明B细胞影响了破骨细胞和成骨细胞的分化，但是由于骨折愈合过程中骨髓微环境的复杂性，B细胞在骨折愈合中的作用机制尚不清楚。

今天小编为大家带来了一篇由第二军医大学附属长海医院纪方教授团队在Frontiers in Endocrinology（IF=5.555）发表的题为“Single-Cell RNA Sequencing Reveals B Cells Are Important Regulators in Fracture Healing”的文章，揭示了B细胞在骨折愈合过程中发挥的重要作用，对骨折等骨疾病治疗策略具有重要意义。

烈冰生物参与了本次单细胞测序实验和数据分析工作，下面请跟随小编的步伐，来看看这篇文章的研究思路和结果分析吧~

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样本信息

1例（＜5 d）骨折组织

1例（＞30d ）骨折组织

小鼠骨折组织（0、3、7、14d）

技术手段

单细胞转录组测序

免疫荧光、免疫印迹、TRAP染色

捕获平台

BD Rhapsody

研究结果

1、骨折组织的单细胞图谱分析

研究者总共对9339个细胞进行了单细胞测序，通过细胞聚类分析和鉴定，获得了13种细胞类群，包括6个中性粒细胞群、2个早期红细胞群、2个T细胞群、1个B细胞群、1个浆细胞群和1个单核细胞群。另外对比新、旧骨折组织的细胞群发现，B细胞在数量上存在显著的统计学差异（图1）。

图1 人新、旧骨折组织单细胞图谱

2、骨折组织的B细胞鉴定

为了探究B细胞在骨折愈合中的作用，研究者利用subCluster分析，将B细胞定义为5个细胞亚群（图2）：pDC细胞（表达CLEC4C），pro-B细胞（表达HLA-DRA和CD74），成熟B细胞（表达CD23和CD24）和浆细胞（包括P1和P2，表达J-chain）。经过统计分析发现（表1），相较于新骨折组织（Control组），骨折30天的组织（Case组）B细胞数量显著减少，拟时序分析发现Case组各时期B细胞构成与对照组相似，在血肿形成阶段，所有B细胞亚群均减少，提示了B细胞可能影响了骨折愈合过程。

图2 人骨折组织B细胞分群分析

表1 新、旧骨折组织不同免疫细胞类型数量占比

3、小鼠骨折模型中B细胞的研究

进一步，研究者建立了小鼠骨折模型（图3），分别在0、3、7、14d采集小鼠骨折组织细胞，获得6个B细胞亚群：T2B、T1B、B1、B2、B1b1和B1b2。通过拟时序、细胞通讯、GO富集分析和免疫荧光染色发现，在骨痂形成过程中，B细胞的减少促进了成骨细胞和破骨细胞的分化，而在骨痂愈合过程中，B细胞的增加抑制了成骨细胞和破骨细胞的分化（图4），即B细胞在骨折愈合过程中发挥了重要作用。

图3 小鼠骨折模型

图4 小鼠骨折模型中B细胞的作用

4、B细胞外泌体体外和体内作用

研究者进一步通过体外细胞培养实验发现，与B细胞共培养后，破骨细胞分化增加，成骨细胞分化减少。后经过免疫印迹、RT-qPCR等实验（图5），证实了B细胞外泌体在体外抑制成骨细胞分化，促进破骨细胞形成。

图5 B细胞外泌体体外实验

最后研究者将B细胞外泌体注射到小鼠体内连续8周，发现实验组小鼠的骨小梁体积、数量和厚度显著低于对照组，骨小梁间距显著高于对照组（图6）。

图6 B细胞外泌体体内实验

结论

综上所述，文章通过单细胞转录组测序等技术，解析了在骨折愈合不同阶段，骨髓微环境中免疫细胞类型的变化，发现B细胞在骨折愈合过程中的重要作用。另外，B细胞外泌体可以调节成骨细胞和破骨细胞的分化，为B细胞外泌体研发治疗骨折或骨质疏松等疾病的纳米药物提供新的思路。

原文链接

https://doi.org/10.3389/fendo.2021.666140