俗话说：“牙痛不是病，痛起来真要命。”不注重维护口腔健康，只有等到牙痛，口臭等病症出现之后才会引起人们的警觉，例如龈炎未能及时治疗，炎症可由牙龈向深层扩散至牙周膜、牙槽骨和牙骨质而发展成牙周炎。牙周炎是牙周组织的慢性炎症，会导致牙槽骨破坏和失牙，我国成年人发病率高达80%。

本期，小编为您带来一篇南京医科大学口腔医学院孙雯老师团队（陈玥硕士为第一作者）在Theranostics（IF=11.556）上发表的文章，题目为Single-cell RNA landscape of the osteoimmunology microenvironment in periodontitis。该文章主要利用单细胞测序技术等，创新性的从细胞层面揭示了牙周炎患者牙周组织的骨免疫微环境，为探究牙周炎的发病机制及牙周炎牙槽骨的再生途径提供了新思路。

烈冰生物参与本研究中的单细胞测序和数据分析工作，下面我们一起了解一下本文的研究思路和数据分析过程。

# 样本信息 #

样本类型：

牙周组织（包括牙槽骨，牙龈，牙周膜三部分）

实验样本：

健康对照(HCs)  n=4；

重度牙周炎患者(PDs)  n=5；

经牙周基础治疗后一个月内的重度牙周炎患者(PDTs)  n=3。

# 主要的单细胞分析工具 #

subCluster分析，QuSAGE分析，差异基因表达分析，拟时序分析，细胞通讯分析

# 捕获平台 #

BD Rhapsody

# 研究结果 #

1. 牙周组织的细胞鉴定

为了探讨牙周组织中细胞群的构成，作者对4名健康对照（HCs）、5名重度牙周炎患者（PDs）、3名牙周基础治疗后一个月内的重度牙周炎患者（PDTs）的牙周组织进行单细胞测序实验，总共获得51248个细胞，鉴定出了10种主要细胞群体，分别是T细胞，B细胞，浆细胞，内皮细胞，中性粒细胞，单核细胞，成纤维细胞，肥大细胞，上皮细胞，髓源性抑制细胞(MDSC)。进一步，作者比较了不同细胞群体的占比情况，在疾病组（PD组）中，T细胞与健康组（HC组）相比明显减少，治疗后（PDT组）有所恢复；PD组中的上皮细胞和内皮细胞较HC组显著增加；PD组中成纤维细胞的占比在三组中最高。

2. 成纤维细胞（Fibroblast）的亚型鉴定

大量的研究表明，成纤维细胞在调节组织稳态，协调炎性反应，介导组织损伤等方面有重要作用。基于本研究，作者发现在基础治疗后，牙周炎患者的牙周组织中成纤维细胞显著下降，对其细分后鉴定出了4种细胞亚型：成纤维细胞，周细胞，肌成纤维细胞和增殖细胞，而细分后的成纤维细胞又可分为两大类群，分别是具有功能异质性成纤维细胞和成骨谱系细胞（CD55⁺ 间充质干细胞（MSCs），APOE⁺ 成骨前体细胞，IBSP⁺ 成骨细胞）。值得注意的是，成骨谱系细胞包括MSCs、成骨前体细胞、成骨细胞均在牙周炎治疗后（PDT组）显著下调，提示这可能是牙周炎治疗后牙槽骨再生困难的原因。

3. 成骨谱系细胞分化分析

随后，作者利用流式细胞分选技术从牙周组织中分离出CD55⁺NT5E⁺LepR⁺ 细胞，在体外进行三系分化诱导培养，发现CD55⁺NT5E⁺LepR⁺ 细胞具有多向分化潜能；利用免疫荧光发现，牙周炎患者中CD55⁺LepR⁺ 间充质干细胞减少。进一步，作者利用scVelo和拟时序分析探究了成骨细胞谱系的分化过程，预测牙周组织中MSCs向成骨前体细胞和成骨细胞方向的分化。

4. 周细胞的多谱系分化潜力

基于周细胞具有自我更新、组织修复和再生的能力，可能在牙周炎治疗后作为成骨谱系细胞的潜在替代细胞。因此，作者对周细胞和肌成纤维细胞进行亚群分析，并利用拟时序分析推测了细胞亚群的分化方向，发现CXCL12⁺ MSC-like周细胞是分化的起点，有向POSTN⁺/SPON2⁺ 周细胞和MYH11⁺/ACTA2⁺ 肌成纤维细胞分化的趋势。进一步分析发现POSTN⁺/SPON2⁺ 周细胞分化方向富集参与“成骨细胞分化”、“骨化”和“骨骼系统发育”的相关基因，提示存在成骨分化潜能。

5. 破骨细胞分化轨迹

基于单核细胞谱系对炎症的反应与作用，参与骨损伤的功能，作者对单核细胞系进行subCluster分析，鉴定出2个单核细胞亚群、3个巨噬细胞群、1个破骨细胞群和1个树突状细胞群；为探究破骨细胞系的转化历程，作者重建了单核细胞、巨噬细胞和破骨细胞的发育轨迹，并进一步利用GO Pathway分析，发现在破骨细胞形成的最后阶段，不仅细胞分化和矿物质吸收相关的通路显著富集，与免疫反应、抗原处理和呈递及炎症反应相关的基因也显著表达，表明牙周组织中破骨细胞具有促进炎症的功能。

6. 内皮细胞亚群分析

鉴于患者样本（较HC组）中存在大量的内皮细胞，作者对内皮细胞进行了进一步分析，鉴定出了4种亚群细胞：静脉内皮细胞、动脉内皮细胞、淋巴内皮细胞和增殖内皮细胞。随后的SCENIC分析发现，转录因子SOX17和TEAD3参与了稳态和炎症条件下的动脉再生，可导致牙周微环境中动脉内皮细胞的改变，引起内皮细胞的显著增加。

7. T细胞和B细胞异质性

基于T细胞和B细胞在调节慢性炎症中的重要作用，作者对T细胞进行进一步分析，确定了三种T细胞类型，分别是NKT细胞、CD4⁺ T细胞和CD8⁺ T细胞，而CD8⁺ T细胞又可以细分为7种亚型（CD8⁺ T_Effector，CD8⁺ T_EMRA等）。通过QuSAGE分析发现，与HC组相比，PD组中CD8⁺T细胞的NOD-like受体信号通路、IL17信号通路、TNF信号通路等显著激活。另外与免疫检查点基因（TIGIT, CD96, CD44）在CD8⁺ T细胞中显著上调。B细胞群体也可进一步分为3种细胞亚群，进一步利用GO Pathway分析，发现较HC组，PD组中与炎性特异性反应相关的通路，抗原加工和呈递通路等被激活。

8. 牙周组织中的细胞通讯

为了阐明骨骼细胞谱系和免疫细胞间的细胞互作关系，作者利用了CellPhoneDB分析，发现有26942个配受体对在三组样本中共同存在。而在内皮细胞和成骨前体细胞中，大多配受体关系主要存在于Ephrin-Eph信号通路上（参与机体多种生理病理的活动，如骨的重塑、组织修复和纤维化等）。最后作者利用免疫荧光技术，检测了Ephrin A1（内皮细胞表达）和Eph A7（成骨前体细胞表达）的定位情况，发现HC组的牙槽骨表面有大量的Eph A7⁺ALP⁺成骨前体细胞，而PD样本Eph A7⁺ALP⁺ 成骨前体细胞显著下降，反而存在大量的Ephrin A1⁺CD31⁺内皮细胞。

在本研究中作者利用单细胞转录组测序，全面描绘了牙周炎骨免疫微环境细胞类型的精细变化，揭示单个细胞基因开启或关闭的综合景观，勾勒骨骼细胞与免疫细胞间信号通讯的复杂过程，为深入解析牙周炎牙槽骨再生的细胞和分子机制提供了创新见解。

原文链接

https://thno.org/v12p1074.htm