癌症的特征之一是逃避免疫系统杀伤，N6-甲基腺苷（m6A）是真核生物中一种常见的内源性修饰。研究表明，m6A甲基化在逃避免疫系统破坏中具有重要功能。YTHDF1是一种多功能、强大的m6A reader，近年来在抗肿瘤免疫调节中的作用逐渐成为研究热点，但YTHDF1对免疫逃逸的影响还知之甚少。

        近日，烈冰合作伙伴上海质子重离子医院孔琳教授团队在Nature Communications（IF=17.694）上发表了题为“Tumor-intrinsic YTHDF1 drives immune evasion and resistance to immune checkpoint inhibitors via promoting MHC-I degradation”的论著。该研究通过单细胞测序技术（scRNA-seq）揭示了肿瘤固有的YTHDF1驱动免疫逃逸和免疫检查点抑制剂（ICI）抵抗，YTHDF1缺失促使免疫系统恢复监测。

烈冰生物承担了本研究中的单细胞测序和数据分析工作，下面跟随小编的步伐，一起来看看本文的实验设计和研究成果吧~

实验设计

单细胞实验分组：Ythdf1-KO肿瘤（n = 3），WT肿瘤（n = 3）

主要技术手段：CRISPR/Cas9基因编辑、转录组测序、单细胞测序、TMT蛋白质组、免疫组化、免疫荧光检验法、免疫沉淀（eCLIP）、Western blot等

捕获细胞数：29325个CD45⁺免疫细胞

单细胞捕获平台：烈冰生物10x Genomics平台

单细胞分析工具应用：烈冰生物NovelBrain^®云平台：细胞聚类、GO分析、Pathway分析、拟时序分析等

研究结果解析

01 YTHDF1与ICI耐药性相关

基于TCGA-皮肤黑色素瘤（SKCM）数据集进行免疫评分，作者发现在m6A调控因子中，YTHDF1 RNA与免疫评分呈显著负相关，提示其可能在调节免疫逃逸中发挥作用。单样本基因集富集分析表明，肿瘤固有YTHDF1呈现“免疫荒漠”表型。此外，对ICI治疗具有耐药性的黑色素瘤B16/F10细胞系中，YTHDF1表达显著上调。通过分析现有转录组数据，YTHDF1的高表达与ICI治疗的耐药性有关，与其他m6A reader相比，YTHDF1发挥了更重要的作用。

图1 YTHDF1与“免疫荒漠”表型和ICI耐药性相关

02 YTHDF1缺失抑制肿瘤生成

基于CRISPR/Cas9系统，作者构建了Ythdf1缺失的黑色素瘤B16/F10细胞（Ythdf1-KO），发现其与野生型B16/F10细胞（WT）在增殖能力和活力上没有差异。进一步皮下注射到正常/免疫缺陷小鼠中发现：免疫缺陷小鼠中，Ythdf1-KO组与WT组之间的肿瘤体积和重量没有差异；在正常小鼠中，YTHDF1缺失显著抑制了肿瘤的生成。

图2 YTHDF1缺失抑制正常小鼠的肿瘤生成

03 Ythdf1-KO和WT小鼠肿瘤的免疫景观

       为了进一步揭示免疫微环境的异质性，作者进行了单细胞转录组测序（Ythdf1-KO和WT肿瘤浸润CD45⁺免疫细胞），获得了22个细胞亚群并进一步划分为10种免疫细胞群体。其中T细胞、NK细胞和增殖混合免疫细胞在Ythdf1-KO肿瘤中富集，而中性粒细胞和B细胞在WT肿瘤中浸润程度更高。细胞类型和占比在KO组和WT组之间表现出明显的差异。

图3 Ythdf1-KO和WT小鼠肿瘤的免疫微环境

       深入研究发现，在CD4⁺ T细胞进一步可细分为naive CD4⁺ T细胞、effector memory CD4⁺ T细胞（CD4⁺ TEMs）、regulatory CD4⁺ T细胞（Tregs）、proliferating CD4⁺ T细胞和IFN-responsive CD4⁺ T细胞。其中KO组中naive CD4⁺ T细胞只占6%，而CD4⁺ TEMs，Tregs等相较于WT组明显增加。KEGG和GO富集结果均显示，一系列免疫相关通路（如：抗原加工和呈递、T细胞受体信号通路等）在CD4⁺ TEMs、proliferating CD4⁺ T细胞中上调。综上，KO组中proliferating CD4⁺ T细胞和CD4⁺ TEMs亚型的免疫功能强于WT组。

图4 CD4⁺ T细胞分析结果

        CD8⁺ T细胞可进一步细分为4种T细胞亚型，其中KO组肿瘤表现出更多的CD8⁺ T细胞浸润。体外细胞毒性实验显示，KO组肿瘤浸润CD8⁺ T细胞比WT组具有更强的体外杀伤能力。而大量中性粒细胞（特别是肿瘤相关中性粒细胞）多浸润在WT肿瘤中。如上结果说明肿瘤固有YTHDF1缺失促进了抗肿瘤免疫细胞的浸润，并通过重新构建TME来减少促肿瘤免疫细胞。

图5 CD8⁺ T细胞分析结果

04 YTHDF1缺失增强了ICI治疗效果

       通过比较WT组和KO组之间的免疫检查点分子发现，在肿瘤细胞中，YTHDF1缺失会增加PD-L1蛋白在体内的表达，而抗PD-L1或抗CTLA-4抗体治疗可以显著减小Ythdf1-KO组的肿瘤体积。其中87.5%的抗CTLA-4和75%抗PD-L1治疗的小鼠表现出了肿瘤完全排斥并实现无瘤生存。YTHDF1缺失将冷肿瘤转化为热肿瘤，其与ICI协同治疗显著延长总生存期；携带Ythdf1-KO细胞、并被ICI治愈的小鼠可以抵抗WT肿瘤的再次攻击，这表明这种联合疗法可以引发有效、持久的免疫记忆，避免肿瘤复发。

图6 YTHDF1缺失会增强ICI治疗效果

    

        结合蛋白质组学，YTHDF1缺失抑制了溶酶体基因的翻译过程，并限制了MHC-I和抗原的溶酶体蛋白水解，最终增强了免疫系统对肿瘤的识别能力，恢复肿瘤免疫监测。

图7 YTHDF1促进MHC-I水解

图8 外泌体介导的YTHDF1缺失通过恢复体内抗肿瘤免疫来延缓肿瘤生成

全文总结

        综上，本研究阐明了肿瘤固有YTHDF1在驱动免疫逃逸中的作用及其潜在机制。YTHDF1缺失可增强CD8⁺和CD4⁺ T细胞的浸润来改变TME的组成，同时也会限制MHC-I和抗原的水解，最终恢复肿瘤免疫监测，并引发了强大的抗肿瘤免疫。此外，该研究开发了一种外泌体诱导的CRISPR/Cas9传递系统，该系统可消耗YTHDF1并恢复肿瘤免疫监测，为抑制和治疗肿瘤细胞提供新的研究思路。

图9 YTHDF1驱动免疫逃逸的机制

上海质子重离子医院孔琳教授为本文的通讯作者，上海质子重离子医院林万尊为本文第一作者。

本研究详细信息参见原文链接：10.1038/s41467-022-35710-7

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