近日，《基因组蛋白质组与生物信息学报》（Genomics, Proteomics & Bioinformatics, 简称GPB）公布了2022年度“中国生物信息学十大进展”，针对肝脏肿瘤免疫微环境中的中性粒细胞的大队列研究成果《Liver tumor immune microenvironment subtypes and neutrophil heterogeneity》上榜。

值得注意的是，该研究采用124例肝癌患者病例的160个样本，8只小鼠的29个新鲜组织样本，基于Drop-seq技术（10x Genomics平台)进行了大队列中性粒细胞在肝癌的免疫微环境亚型的异质性研究。

01.实验设计

团队采用肝癌患者160个样本(124个病例），29个新鲜组织（8只小鼠），通过无抗体富集进行了单细胞转录组测序。此外，对84个配套病例进行了外显子测序并收集了8个单细胞数据集、453个组织转录组数据和10个空间转录组数据，进行了数据的联合分析。

单细胞捕获技术：Drop-seq

单细胞捕获平台：10x Genomics

单细胞数据分析工具：细胞聚类分析，subCluster分析，差异基因表达分析，GO/Pathway分析，基因集富集分析，公共数据（单细胞、转录组、空间转录组）联合分析等

主要技术手段：scRNA-seq、多色免疫荧光、ATAC-seq、外显子测序等

02.分离中性粒细胞实验方法

        中性粒细胞是一类“娇滴滴”的细胞，通常在体内进入外周血后存活不超过一周，体外存活不超过24小时。脆弱细胞更需要温和的呵护，且先前的肝癌单细胞研究中均未报道过中性粒细胞的存在。

        本研究中，团队也强调了中性粒细胞获取的特殊性。针对样本前处理环节，研究团队对组织样本保持最小的操作时间，仅采用MACS死细胞去除处理细胞悬液，将样本前处理时间从手术后缩短（肿瘤和邻近肝组织）到2h内（包括PCR反转录的实验过程），延长处理时间可能导致中性粒细胞捕获失败。

数据分析环节，中性粒细胞UMI检测范围设置为100-6000，其他细胞群的UMI检测范围保持在500-6000，最终在基因CSF3R、S100A8和S100A9表达的基础上，共鉴定出34307个中性粒细胞。

03.主要实验结果解析

基于生信数据分析，团队系统解析出89个细胞亚群，包括11个首次发现的中性粒细胞亚群，基于聚类分析，获得了5种不同的免疫微环境亚型，包括免疫激活型；髓系富集免疫抑制型；基质富集免疫抑制型；免疫排斥型和免疫驻留型。

11个中性粒细胞亚群中，团队成功鉴定出6群肿瘤相关中性粒细胞，分别富集在外周血、癌旁和肿瘤组织中。其中两个中性粒细胞亚群CCL4+ TAN和PD-L1+ TAN可能促进了肿瘤的生长。基于细胞共培养、转录组测序、ATAC-seq和多色免疫荧光等实验，团队发现CCL4+ TAN招募肿瘤相关巨噬细胞仅为促进肿瘤生长，而PD-L1+ TAN抑制了CD8+ T细胞的杀伤能力。

基于小鼠肝癌自发肿瘤模型，团队利用Anti-Ly6G抗体进行治疗，发现小鼠中性粒细胞去除后有效遏制了肝癌的生长，其骨髓、外周血、癌旁和肿瘤组织的中性粒细胞亚群的开始发生动态变化，中性粒细胞有望成为肝癌免疫治疗的新靶点。

04.烈冰PanoCell^®单细胞服务方案有效应对中性粒细胞的单细胞测序研究

结合烈冰既往测序服务经验和该文章发表情况，基于Cyto-seq的微孔捕获技术依靠细胞在微孔中的重力沉降作用，捕获过程比较温和，无需其他通电加压等强刺激操作，对此类敏感脆弱的细胞损伤可能较小，对实验前处理操作要求的包容性也相对更高，更适合此类特殊项目的研究。烈冰自主研发PanoCell蜂巢板，采用微孔捕获细胞技术，可有效获得中性粒细胞。

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