一 引言

1.1编写目的

进行该测试以及撰写此报告有以下几个目的

1.通过对测试结果的分析，得到对软件质量的评价；

2.分析在Illumina测序平台下，tophat能够获得最大junction数目以及mapping率的参数；

3.分析在ionproton测序平台下，tophat能够获得最大junction数目以及mapping率的参数；

4.尝试找到参数与测序长度的经验性关系。

1.2背景

Tophat是一个RNA-seq数据分析工具，其核心程序是bowtie或bowtie2.可以快速的确认exon-exon剪切拼接。其上游软件是Bowtie，下游软件是Cufflinks。

理论上，Tophat是针对Illumina Genome Analyzer开发的，针对75bp以上长度的短序列进行了优化。该软件是现在二代测序回帖软件中使用最广泛的软件。

Illumina属于二代测序中最经典的平台之一。其测序长度为几十bp。

Ionproton属于二代测序中较新的平台，可以认为是二点五代测序平台，其测序长度平均在100个bp以上。目前我们公司使用的就是这个平台的进行二代测序分析。

在目前公司的数据分析中，出现主要的问题是使用tophat进行ionproton平台分析时，默认参数的mapping率较低，同时该参数产生的junction数也很低，不足以进行差异可变剪接分析。因此，提出此次工作内容，探索更好的参数配置，提高mapping率以及junction数目。

1.3用户群

主要读者：公司研发部，公司管理人员。

其他读者：项目及销售相关人员。

1.4 数据对象：

1.5 测试阶段

软件测试

1.6测试工具

Samtools version：0.1.18；

IGV version：2.3.18；

Awk；

1.7 参考资料

《Tophat user guide》

二 测试概要

关于Tophat参数测试从2013年9月10日开始到2013年9月17日结束，共持续7天，一共94个测试用例，平均每个参数测试15次。

2.1工作计划进展

针对Illumina平台：

测试参数	计划开始时间	实际开始时间	计划完成时间	实际完成时间	工作完成情况
Anchor-length	2013年9月10日	2013年9月10日	2013年9月10日	2013年9月10日	顺利
Max-insertion	2013年9月10日	2013年9月10日	2013年9月10日	2013年9月10日	顺利
Max-deletion	2013年9月10日	2013年9月10日	2013年9月10日	2013年9月10日	顺利
Splice-mismatch	2013年9月10日	2013年9月10日	2013年9月10日	2013年9月10日	顺利
Read-mismatch	2013年9月11日	2013年9月11日	2013年9月12日	2013年9月12日	顺利
Read-gap-length	2013年9月11日	2013年9月11日	2013年9月12日	2013年9月12日	顺利
Read-edit-dist	2013年9月11日	2013年9月11日	2013年9月12日	2013年9月12日	顺利
Segment-length	2013年9月12日	2013年9月12日	2013年9月12日	2013年9月12日	顺利

针对ionproton平台：

测试参数	计划开始时间	实际开始时间	计划完成时间	实际完成时间	工作完成情况
Anchor-length	2013年9月16日	2013年9月16日	2013年9月16日	2013年9月16日	顺利
Max-insertion	2013年9月16日	2013年9月16日	2013年9月16日	2013年9月16日	顺利
Max-deletion	2013年9月16日	2013年9月16日	2013年9月16日	2013年9月16日	顺利
Splice-mismatch	2013年9月16日	2013年9月16日	2013年9月16日	2013年9月16日	顺利
Read-mismatch	2013年9月16日	2013年9月16日	2013年9月16日	2013年9月16日	顺利
Read-gap-length	2013年9月16日	2013年9月16日	2013年9月16日	2013年9月16日	顺利
Read-edit-dist	2013年9月16日	2013年9月16日	2013年9月16日	2013年9月16日	顺利
Segment-length	2013年9月16日	2013年9月16日	2013年9月16日	2013年9月16日	顺利

2.2测试执行

此次测试严格按照项目计划和测试计划执行，按时完成了测试计划规定的测试对象的测试。针对测试计划制定规定的测试策略，依据测试计划和测试用例，将网络数据以及我们观测的关键参数进行了完整的测试。

2.3测试用例

2.3.1功能性

测试主要实现，包括较高的mapping率以及较多的junction数目。

三 测试环境

3.1软硬件环境

四 测试结果

4.1针对Illumina测序平台数据

为简化回帖工作量，从测试的数据中提取了20万条reads数据进行单端测试。

通过测试，统计出anchor-length长度对于junction数目关系如下图所示：

通过测试数据可以知道对于Illumina测序平台数据而言，当anchor-length大于10以后，junction数目显著降低，而在5到10这个范围内没有显著变化。

通过测试数据可以知道对于Illumina测序平台数据而言，当anchor-length大于10以后，mapping率降低，但是可以通过竖轴可以观测出这个mapping率的变化并不明显。

通过测试数据可以知道对于Illumina测序平台数据而言，junction数目与mapping率基本成正比关系。

通过测试数据可以知道对于Illumina测序平台数据而言，read-mismatch数字升高与junction数目基本成反比关系，随着read-mismatch数目变长，junction数目急速降低。

通过测试数据可以知道对于Illumina测序平台数据而言，read-mismatch数字升高与mapping率基本成正比关系，随着read-mismatch数目变长，mapping率上升明显。

通过测试数据可以知道对于Illumina测序平台数据而言，read-gap数字升高与mapping率基本成正比关系，随着read-mismatch数目变长，mapping率上升。整体上升大约1.2%。

通过测试数据可以知道对于Illumina测序平台数据而言，segment长度升高与junction的数目关系，在二十以内时，segment长度变长，junction数目上升明显。随着read-mismatch数目变长，mapping率上升。整体上升大约1.2%。

3.2针对ionproton测序平台数据

为简化回帖工作量，从测试的数据中提取了20万条reads数据进行单端测试。

由于有了对于Illumina平台的工作支持，所以针对ionproton的测试工作速度提高很多。

由于我们统一了read-mismatch参数，read-gap参数，以及read-edit参数。所以这三个参数的测试图都可以从上图中看出信息。

通过测试数据可以知道对于ionproton测序平台数据而言，针对同一anchor-length长度而言，长度8和长度15，16的情况下junction数目可以一致，所以认为anchor-length对junction数目影响不明显。

通过测试数据可以知道对于ionproton测序平台数据而言，针对同一max-deletion长度而言，长度3和长度5的情况下junction数目可以一致，所以认为max-deletion对junction数目影响不明显。

由于我们统一了max-insertion参数，max-deletion参数。所以这两个个参数的测试图都可以从上图中看出信息。

通过测试数据可以知道对于ionproton测序平台数据而言，在segment-length小于36时，可以发现随着segment-length长度变长，junction数目升高。而在36以后这个数字下降，但是总体比30以内长度的大。

通过测试数据可以知道对于ionproton测序平台数据而言，在segment-length小于36时，可以发现随着segment-length长度变长，mapping总体目升高。而在36以后这个数字有下降的情况，但是总体比30以内长度的大。

五．测试结论

通过查阅已经有的资料，我们知道Illumina测序平台和ionproton平台最直观的差别在于后者的平均测序长度比前者长；在我们测试的例子中，Illumina的测序长度在50-97个bp之间，而ionproton的测序长度在50到235个bp之间。从此可以看出两者的最合适参数应该是有差别的。通过我们的参数实验，可以知道，对于Illumina测序平台有如下实验结果：

1.贴合长度越短，匹配的reads数越高，相应的mapping率也在一定范围内会升高。可知，只需要在anchor-length在5-10以内进行讨论。随着a参数的增加（从5到10），junction下降的数据很低，几乎维持不变。因此可以认为在5-9的范围内可以任意取值。

2.前三个参数对于序列的discard没有影响。

3.随着第一项参数的增加，junction数目下降很明显，然而mapping率却增加的很快。推测这个原因可能是因为更多的junction序列由于容错而变成能够匹配了。所以为了mapping率而言，我认为用默认参数就可以。

4.第二项参数的变化对于junction数并没有影响，对于mapping率有一些影响，但是很小。可以再0~第三项参数之间随意选取。

5.第三项参数的变化对mapping率影响很小。但是对junction的影响很大，发现这个参数越小，junction数越高。第三个参数对于junction的影响很大，这个值越小越好，由于前两个参数应该小于或等于这个参数，当第三个参数为0时，mapping率下降非常厉害，所以不将前三个参数设置为0，

6.当segment-length为22的时候效果最好。

对于ionproton测序平台而言，我们可以获得如下结论：

1.anchor-length，max-deletion，max-insertion，splice-mismatch参数的变化对于junction数目，mapping率影响不大。

2.在tophat的所有的参数中，read-mismatch，read-gap以及read-edit对于mapping率的影响很大，我们发现在这三个参数都设置为6的时候mapping率能够提升很多，变成默认参数情况下的两倍的mapping率。

3.我们发现segment-length参数对于junction数目变化有很大影响，其中，当segment-length为36时，相比默认参数6074junction数目而言，此时的junction数目为9368.总体而言，提升效果是显著的。

六．最后测试的参数

对于20万reads的实验样本而言，参数及结果如下：

测试平台	read-mismatch	read-gap-length	read-edit-dist	a	m	maxinsertion	max-deletion	segment	junction_num	unmapped
Illumina	1	1	1	8	1	3	3	22	4957	42902
ionproton	6	6	6	8	0	5	5	36	9368	96725