1、SPAdes简介
1.1 支持的数据类型

当前版本的SPAdes，输入文件可以是Illumina或者IonTorrent数据并且，可以结合PacBio的数据进行组装。

SPAdes的3.8.2版本，支持paired-end reads, mate-pairs and unpaired reads。多个paired-end 和mate-pair文库的数据可以同时输入。SPAdes最初开发的目的适用于小的基因组组装，测试都是基于单细胞和标准的细菌及真菌数据。

SPAdes 3.8.2版本，包含有一个宏基因组分析流程metaSPAdes和一个从WGS中提取和组装质粒的流程plasmidSPAdes，另外，SPAdes 有独立的组装多倍体杂合基因和TruSeq barcode组装的模块。

1.2 SPAdes 流程

SPAdes有一些单独的模块：

a.  BayesHammer---用于Illumina reads的read error correction 工具

b. IonHammer--- 用于IonTorrent 数据的reads error correction 工具

c. SPAdes---迭代 short-read 基因组组装模块；K值根据read 长度自动选择

d. MismatchCorrector--- 用于改善组装得到的contigs和scaffolds中的mismatch 和short indel率的工具

e. dipSPAdes---组装多倍体杂合基因组的分析模块

f. truSPAdes---用于Illumina 产生的short reads的组装

推荐使用 BayesHammer/IonHammer 来获取高质量的组装结果。

2. SPAdes的安装

系统要求：

(1) 64-bit Linux

(2)  安装Python （支持的版本有2.4，2.5，2.6， 2.7， 3.2， 3.3， 3.4 和 3.5）

下载地址：http://spades.bioinf.spbau.ru/release3.8.2/SPAdes-3.8.2-Linux.tar.gz 下载后解压即可：

tar -xzf SPAdes-3.8.2-Linux.tar.gz

cd SPAdes-3.8.2-Linux/bin/

测试是否可以正常运行：

./spades.py --test

如果输出的信息最后为：

===== Assembling finished. * Corrected reads are in spades_test/corrected/ * Assembled contigs are in spades_test/contigs.fasta * Assembled scaffolds are in spades_test/scaffolds.fasta======= SPAdes pipeline finished.SPAdes log can be found here: /home/andrey/ablab/algorithmic-biology/assembler/spades_test/spades.logThank you for using SPAdes!

则说明软件可以正常运行。

3. SPAdes的使用

3.1 输入文件

输入文件可以是paired-end reads, mate-pairs and single (unpaired) reads in FASTA and FASTQ。对于IonTorrent 数据输入文件可以是unmapped BAM 文件。然而，如果要做error correction, reads应该是FASTQ 或者 BAM文件格式。

Illumina 数据和IonTorrent 文库的数据不能放在一起组装，其他类型的输入文件可以放在一起。

SPAdes 支持仅有 mate-pair的组装，然而，此时我们推荐使用高质量的mate-pair文库。

注意：

1. 不推荐使用SPAdes进行覆盖度太低（小于5x）的PacBio reads 组装

2. 不推荐使用SPAdes软件进行大基因组的PacBio reads组装

3. SPAdes输入文件可以是压缩文件

PacBio 和 Oxford Nanopore reads

对于PacBio CLR 和 Oxford Nanopore reads 用于混合组装（例如：结合Illumina 或者 IonTorrent数据），此时不需要reads纠错，SPAdes 将使用PacBio CLR 和 Oxford Nanopore reads 用于 gap closure 和处理重复。

对于PacBio 的数据需要是过滤后的subreads，文件格式为 FASTQ/FASTA格式，参数为--pacbio。

3.2 Examples

/home/novelbio/software/SPAdes-3.8.2-Linux/bin/spades.py --pe1-1 /home/novelbio/software/SPAdes-3.8.2-Linux/share/spades/test_dataset/ecoli_1K_1.fq.gz --pe1-2 /home/novelbio/software/SPAdes-3.8.2-Linux/share/spades/test_dataset/ecoli_1K_2.fq.gz -o spades_test

（1）如果同一文库有多个文件的时候，使用方法如下：

spades.py --pe1-1 lib1_forward_1.fastq --pe1-2 lib1_reverse_1.fastq --pe1-1 lib1_forward_2.fastq --pe1-2 lib1_reverse_2.fastq -o spades_output

注意顺序要一致

（2）当输入文件是interlacing paired-end reads 或者 unpaired reads时

spades.py --pe1-12 lib1_1.fastq --pe1-12 lib1_2.fastq --pe1-s lib1_unpaired_1.fastq --pe1-s lib1_unpaired_2.fastq -o spades_output

（3）当输入文件是一些paired-end 和 mate-pair reads时，

paired-end library 1

lib_pe1_left.fastq

lib_pe1_right.fastq

mate-pair library 1

lib_mp1_left.fastq

lib_mp1_right.fastq

mate-pair library 2

lib_mp2_left.fastq

lib_mp2_right.fastq

此时，使用的命令为：

spades.py --pe1-1 lib_pe1_left.fastq --pe1-2 lib_pe1_right.fastq --mp1-1 lib_mp1_left.fastq --mp1-2 lib_mp1_right.fastq --mp2-1 lib_mp2_left.fastq --mp2-2 lib_mp2_right.fastq -o spades_output

（4）当有IonTorrent unpaired reads, PacBio CLR和 相应的contigs时

使用的命令为：

spades.py --iontorrent -s it_reads.fastq --pacbio pacbio_clr.fastq --trusted-contigs contigs.fastq -o spades_output

（5）当single-read library 有多个单独的文件时

使用的命令为：

spades.py --s1 unpaired1_1.fastq --s1 unpaired1_2.fastq --s1 unpaired1_3.fastq -o spades_output

（6）组装IonTorrent reads

输入格式仅支持FASTQ或者BAM文件。对于IonTorrent数据，k-mer值的选择非常重要，如果数据集覆盖度足够，GC含量不高，那么推荐按照long reads的组装方式（e.g. 组装使用k-mer长度 21,33,55,77,99,127）。然而，由于k-mer长度改变会引起错误率的变化，例如，如果运行SPAdes时，设置k-mer长度为21，33,55,77,然后，使用迭代和更大的k-mer值进行组装，可以使用参数，-restart-from k77 -k 21,33,55,77,99,127 --mismatch-correction -o.

对于特殊的数据集（e.g. 高GC，低覆盖度或者覆盖度不均匀），我们建议使用single-cell 模式（设置--sc 选项）并使用k-mer的长度为21,33,55

（7）组装long Illumina paired reads(2x150 and 2x250)

设置迭代的k-mer值，推荐设置--careful 选项，用来减少最终contigs的mismatches数。

不做reads corrected 的组装：  spades.py -k 21,33,55,77 --careful --only-assembler-o spades_output

做reads correct 并组装：spades.py -k 21,33,55,77 --careful-o spades_output

single-cell data set with read lengths 2x150 or 2x250

推荐使用默认的k-mer值，对于single-cell data set SPAdes 选择的k-mer size 21,33,55。

4. SPAdes 的输出

/corrected/ 存放使用BayesHammer纠错后的reads，文件名为 *.fastq.gz或者*.fastq

/contigs.fasta contains resulting contigs 组装的contigs序列文件

/scaffolds.fasta contains resulting scaffolds 组装得到的scaffolds序列文件

/assembly_graph.fastg contains SPAdes assembly graph in FASTG format SPAdes组装graph，以FASTG格式存储

/contigs.paths contains paths in the assembly graph corresponding to contigs.fasta (see details below)

/scaffolds.paths contains paths in the assembly graph corresponding to scaffolds.fasta (see details below)

序列ID说明：

>NODE_3_length_237403_cov_243.207_ID_45

3 表示 contig/scaffold的顺序号；237403 表示序列长度；   243.207 表示k-mer的覆盖深度（一般情况下会低于read的覆盖深度）

组装结果评估：

可以使用QUAST 软件进行结果的统计（N50，maximum contig length,GC% 等）

PREFIX=/ /bin/software/SPAdes-3.10.1/spades_compile.sh

taskSPAdes-dataTypetaskSPAdes-dataType

datadict_getlsDataValues/taskSPAdes-dataType

SPAdes v3.10.1 详细参数

SPAdes genome assembler v3.10.1

Usage: /home/novelbio/bianlianle/software/BacteriaAssemble/SPAdes-3.10.1-Linux/bin/spades.py [options] -o

Basic options:

-odirectory to store all the resulting files (required)

--sc this flag is required for MDA (single-cell) data

--meta this flag is required for metagenomic sample data

--rna this flag is required for RNA-Seq data

--plasmid runs plasmidSPAdes pipeline for plasmid detection

--iontorrent this flag is required for IonTorrent data

--test runs SPAdes on toy dataset

-h/--help prints this usage message

-v/--version prints version

Input data:

--12file with interlaced forward and reverse paired-end reads

-1file with forward paired-end reads

-2file with reverse paired-end reads

-sfile with unpaired reads

--pe<#>-12file with interlaced reads for paired-end library number <#> (<#> = 1,2,..,9)

--pe<#>-1file with forward reads for paired-end library number <#> (<#> = 1,2,..,9)

--pe<#>-2file with reverse reads for paired-end library number <#> (<#> = 1,2,..,9)

--pe<#>-sfile with unpaired reads for paired-end library number <#> (<#> = 1,2,..,9)

--pe<#>-orientation of reads for paired-end library number <#> (<#> = 1,2,..,9;= fr, rf, ff)

--s<#>file with unpaired reads for single reads library number <#> (<#> = 1,2,..,9)

--mp<#>-12file with interlaced reads for mate-pair library number <#> (<#> = 1,2,..,9)

--mp<#>-1file with forward reads for mate-pair library number <#> (<#> = 1,2,..,9)

--mp<#>-2file with reverse reads for mate-pair library number <#> (<#> = 1,2,..,9)

--mp<#>-sfile with unpaired reads for mate-pair library number <#> (<#> = 1,2,..,9)

--mp<#>-orientation of reads for mate-pair library number <#> (<#> = 1,2,..,9;= fr, rf, ff)

--hqmp<#>-12file with interlaced reads for high-quality mate-pair library number <#> (<#> = 1,2,..,9)

--hqmp<#>-1file with forward reads for high-quality mate-pair library number <#> (<#> = 1,2,..,9)

--hqmp<#>-2file with reverse reads for high-quality mate-pair library number <#> (<#> = 1,2,..,9)

--hqmp<#>-sfile with unpaired reads for high-quality mate-pair library number <#> (<#> = 1,2,..,9)

--hqmp<#>-orientation of reads for high-quality mate-pair library number <#> (<#> = 1,2,..,9;= fr, rf, ff)

--nxmate<#>-1file with forward reads for Lucigen NxMate library number <#> (<#> = 1,2,..,9)

--nxmate<#>-2file with reverse reads for Lucigen NxMate library number <#> (<#> = 1,2,..,9)

--sangerfile with Sanger reads

--pacbiofile with PacBio reads

--nanoporefile with Nanopore reads

--tslrfile with TSLR-contigs

--trusted-contigsfile with trusted contigs

--untrusted-contigsfile with untrusted contigs

Pipeline options:

--only-error-correction runs only read error correction (without assembling)

--only-assembler runs only assembling (without read error correction)

--careful tries to reduce number of mismatches and short indels

--continue continue run from the last available check-point

--restart-fromrestart run with updated options and from the specified check-point ('ec', 'as', 'k', 'mc')

--disable-gzip-output forces error correction not to compress the corrected reads

--disable-rr disables repeat resolution stage of assembling

Advanced options:

--datasetfile with dataset description in YAML format

-t/--threadsnumber of threads

[default: 16]

-m/--memoryRAM limit for SPAdes in Gb (terminates if exceeded)

[default: 250]

--tmp-dirdirectory for temporary files

[default:/tmp]

-k comma-separated list of k-mer sizes (must be odd and

less than 128) [default: 'auto']

--cov-cutoffcoverage cutoff value (a positive float number, or 'auto', or 'off') [default: 'off']

--phred-offsetPHRED quality offset in the input reads (33 or 64)

[default: auto-detect]