MutMap的分析方法如下图：

选择EMS处理的突变体进行回交获得F1子代，再自交获得形状分离的F2子代，选择F2中具有突变形状的植株进行混池测序，理论上与突变性状相关的突变率为1，而与突变性状不相关的突变率接近0.5，再绘制snp-index

与染色体位置的图，锁定峰值所在的区域进行验证，如下图：

蓝色的点代表突变位点，红色的线是根据windows分析的结果绘制，每个window包含五个snp位点，纵坐标取突变率的平均值，横坐标取第一和第五的突变位置的中点

图中snp位点的筛选标准如下：

1.突变频率与覆盖度

   纯合位点认为SNP-index大于等于0.9且覆盖度大于等于3

   杂合位点认为SNP-index大于等于0.3且小于0.9，覆盖度大于4

2.去除不同样本间共有突变

   去除掉至少有两个突变方向共有的SNP位点

3.根据EMS诱导突变原理筛选

   由于EMS诱导的突变主要集中在G→A和C→T，所以图中只保留了这两种突变

在文章的附件中给出了一系列不同覆盖度与不同混样数量情况下，性状不相关突变位点在SNP-index上的频率分布图

其中n代表混养池中样本的数量，G代表平均覆盖度，由图中来判断出纯合突变的SNP-index阈值

此外，mutmap方法还考虑了在突变株中存在极少量不突变的样本情况，也给出了在这种考虑下的与性状相关SNP在SNP-index上的频率分布图，如下：

其中j代表假设的未突变样本数，n代表混养池中样本的数量，G代表平均覆盖度

NovelBio实验室数据测试：

本次测试主要使用的测试样本为A，其中陈总给出的突变基因为XXX，所在染色体的位置为：XXXX

测试中使用Varscan算法对xxx与对照组9522样本进行callSNP，提取其中的somatic突变进行后续的分析，其中包含一个在目标基因上发生错义突变的位点，且突变率为1.

由图中可以看出具有高突变率的位点较多，在11号染色体关注基因区域没有明显的峰值，在第一，第四染色体有明显的突变富集，但是突变位点过于密集，经过IGV观察后看到如下情况：

1.目的基因处的突变位点为真，但是突变位点周围没有很多高频突变位点，导致图中没有明显的峰

2.在大量突变位点富集的区域，在对照组中也存在非常多的突变，导致结果不可信，而且在该位点存在过多的位点也使结果不是很可信

3.根据覆盖度的过滤会存在局限性，有部分位点可能同时存在多种突变类型，或者snp和indel共存的情况，这种位点也不是非常可信

4.部分位点存在几个位置接近的纯合突变位点，图中存在不是非常明显峰的区域，但是不在基因的外显子区，未发生氨基酸的改变

初步结论，从图中来看，没有达到文章中出现明显峰的程度，考虑的原因是突变位点过多，产生的干扰比较严重，XXX这个样本的平均覆盖度为24，已经达到文章中提到的（>10×)的要求，但是画图使用的突变位点的数量相差一个数量级，对结果的影响很大。在Mutmap的文章中同时对一批F2子代的多种突变类型进行研究比如高矮，叶片颜色，并删除了很多共有突变（即可能不特异影响突变性状的位点），而且只考虑了G→A和C→T这两种突变类型，这就可以过滤掉非常多的位点。而在我们的测序数据中，只考虑了覆盖度的问题，在我对覆盖度梯度测试时，始终不能达到满意的结果，卡值过低，绘图所使用的突变位点会更多，干扰非常大，如果卡值过高又会丢掉非常多的信息。此外，由于陈总关注的目的基因所具有的突变类型为C→G，而且也不知道具体诱导突变的过程，没有对位点的突变种类进行筛选，这个也是导致突变位点很多的原因之一。

Q69样本补充分析，选择Q69的somatic突变位点进行过滤画图，过滤标准为tumor组覆盖度大于等于8，突变率大于30%，normal组突变率为0，只选择G→A和C→T这两种突变类型进行分析，

总共获得突变位点2173个，结果图片如下：

之后在对覆盖度的卡值进行梯度测试，由于在当时进行varscan分析时平台的tumor最低阈值为8，当卡值为8时获得2173个突变，当卡值为10时获得 当卡值为1085个，15时获得375个突变位点。