肝细胞癌（HCC）是最常见的肝恶性肿瘤，其进展与免疫系统功能密切相关。免疫检查点抑制剂治疗（anti-PD-1 /anti-PD-L1）已经成为晚期肝癌患者的一线治疗方案。

然而，HCC患者长期受炎症刺激可能会使其免疫微环境发展为对免疫治疗耐药的状态。事实上，大多数HCC患者在免疫检查点阻断后都表现出耐药性或复发，这与患者体内肿瘤免疫微环境向肿瘤免疫抑制微环境形成相关。而肿瘤免疫抑制微环境的形成与先天性免疫和适应性免疫的功能失调相关。因此重新塑造免疫微环境成为晚期HCC患者的治疗策略。但不同细胞如何调节肿瘤免疫微环境，使其发展为对免疫治疗产生耐药的具体机制仍不清楚。

烈冰生物合作伙伴海军军医大学东方肝胆外科医院卫立辛、吴东团队与复旦大学周兆才、焦石团队针对上述问题开展了系列研究，于近期在 Journal of Hepatology 期刊发表了题为Immunosuppressive CD10+ALPL+ neutrophils promote resistance to anti-PD-1 therapy in HCC by mediating irreversible exhaustion of T cells 的研究论文。烈冰生物参与了本研究中的单细胞测序和数据分析工作。

下面我们一起了解一下本文的研究思路和数据分析过程~

一、实验设计

1 HCC患者：

样本：抗PD-1治疗响应的HCC患者（n=3），抗PD-1治疗耐药的HCC患者（n=4）

采样组织：肿瘤组织

单细胞捕获平台：BD Rhapsody

2 动物模型：

样本：二乙基亚硝胺（diethylnitrosamine，DEN）诱导的HCC大鼠 （n=6）

采样组织：肿瘤、邻近肝组织、骨髓、外周血、门脉虚血、脾脏

单细胞捕获平台：10X Genomics

主要技术：单细胞测序（scRNA-seq）、流式细胞术、免疫荧光、蛋白质质谱、基因敲除等

Novelbrain云平台分析工具：

细胞聚类分析、拟时序分析、速率分析、差异基因表达分析、转录因子分析（SCENIC）、GSEA基因富集分析、InferCNV等

二、研究结果解析

01 单细胞测序初步分析与细胞类型确认

研究者对7例计划进行抗PD-1治疗的肝细胞癌患者活检组织进行了单细胞测序，根据mRECIST标准，将患者分为抗PD -1敏感组和抗PD -1耐药组，通过scRNA-seq来评估免疫、肿瘤和基质细胞的特性。为了保证后续分析的可靠性，研究者与烈冰的生信团队对数据进行严格的质控，最终得到31,672个细胞。通过细胞聚类分析，共鉴定出7个细胞大类，并使用CNV分析，对肿瘤细胞进行恶性评分。

通过对不同样本和分组的细胞类型进行统计，发现耐药组中的中性粒细胞占比明显低于响应组，而巨噬细胞占比则明显高于响应组。

02 中性粒细胞重聚类鉴定出一个独特的NEU亚群

        考虑到中性粒细胞在两组中出现明显的占比区别，研究者将4,596个中性粒细胞（约占总细胞的14.5%）进行重聚类，得到7个亚群（NEU1-NEU7）。其中，NEU1主要存在于耐药组中，高表达免疫抑制的基因，富集抑制免疫功能的通路，且高表达JAML和CD170两个显著代表前体中性粒细胞免疫抑制功能的基因；而NEU3–6亚群表主要表达抗肿瘤免疫的基因，且PDL1在NEU3和NEU4中特异性富集。

为了研究NEU1细胞和其他细胞群体之间关系，研究人员进行了速率分析和拟时序分析，发现NEU1 群体位于发育的起点，且特异性表达CD10、ALPL、JAML基因。因此将NEU1细胞群体命名为CD10+ALPL+ NEU。

        以上结果确定了不同的中性粒细胞亚群，其独特的分布模式与HCC患者免疫治疗的疗效相关，并进一步表明NEU1可能是一种潜在的免疫抑制群体，是患者产生耐药性的关键。

03 不同亚群的耗竭T细胞对抗PD-1治疗的反应

        耗竭性T细胞（TEX）已被确定为抗PD -1治疗的主要靶点，参与肿瘤进展和免疫逃逸。为了表征TEX细胞在不同抗PD -1反应中的作用，研究人员从7例患者的scRNA-seq数据中提取了T细胞的信息。根据TEX细胞在敏感组和耐药组的分布，将TEX细胞分为三个亚群：TEX Sensitive （TEX^S，主要分布在敏感组)细胞、TEX Resistant （TEX^R，主要分布在耐药组)细胞和TEX^S&R（均匀分布在两组）细胞。对TEX^R细胞和TEX^S细胞进行功能分析，发现TEX^R细胞主要富集免疫抑制的通路上，TEX^S细胞主要富集在免疫激活的通路上。

        通过进行SCENIC分析，研究人员进一步比较了敏感组和耐药组转录因子的活性，发现TEX^S细胞中明显丰富的EOMES活性，据报道，EOMES可介导耗竭T细胞分化和持续的T细胞衰竭。表明抗PD -1耐药患者的TEX^R细胞可能处于衰竭状态，且这种耗竭是不可逆的。

04 CD10+ALPL+ NEUs促进T细胞的不可逆耗竭

为了深入了解CD10+ALPL+ NEUs与T细胞之间的调控关系，研究人员进行了细胞-细胞相互作用分析(CellPhoneDB)。结果表明，耐药患者中分析到CD10+ALPL+ NEUs和TEX细胞之间的相互作用是敏感组的两倍。

05 肿瘤细胞将中性粒细胞转化为免疫抑制性CD10+ALPL+ NEUs

总的来说，肿瘤细胞通过NAMPT-NTRK1信号通路对CD10+ALPL+ NEUs进行重编程，维持未成熟状态，抑制CD10+ALPL+ NEUs的成熟和激活，而CD10+ALPL+ NEUs使T细胞处于不可逆的耗竭状态，导致了患者产生耐药性。

三、总结

本研究采用单细胞测序技术（scRNA-seq），通过比较分析和实验验证，发现在HCC患者中存在一个与抗PD-1治疗的耐药性相关的CD10+ALPL+ 中性粒群体，并进一步发现肿瘤细胞通过NAMPT-NTRK1信号通路对CD10+ALPL+ NEUs进行重编程。

    研究结果揭示了CD10+ ALPL+中性粒细胞使抗PD-1治疗产生耐药的机制，也为新的免疫治疗靶点和可能的协同治疗方案提供了进一步的见解。

原文链接：

https://doi.org/10.1016/j.jhep.2023.08.024