MHC（major histocompatibility complex，主要组织相容性复合体）是一组编码动物主要组织相容性抗原的基因群的统称，这些分子在细胞表面上存在，可以识别并结合来自外界的抗原。MHC分子主要有两种类型：MHC I和MHC II，MHC I分子广泛存在于各种细胞表面上，CD8⁺ T细胞可以与MHC I类分子上的抗原结合，从而杀死感染细胞或肿瘤细胞。

        大多数关于T细胞免疫治疗研究都集中在传统的CD8⁺ T细胞上，因此正确激活CD8⁺ T细胞对于增强肿瘤的免疫反应至关重要，该细胞能够识别由MHC Ia类分子所呈现的肿瘤抗原肽；MHC Ib类分子在结构上与MHC Ia类分子相似，但在特定群体中很少有等位基因。对K^b−/−D^b−/−小鼠（一种不表达MHC Ia位点的转基因小鼠品系）的研究表明，Ib-CD8⁺ T细胞占CD8⁺ T细胞总数的比例不到10%，尽管这些Ib-CD8⁺ T细胞很少，但它们对于控制细胞内细菌和病毒是不可或缺的，而Ib-CD8⁺ T在肿瘤免疫中的作用仍然很大程度上未知。

烈冰生物合作伙伴中国科学院上海营养与健康研究所王莹课题组和时玉舫课题组团队针对上述问题开展了系列研究，于近期在美国国家科学院院刊PNAS 期刊发表了题为：MHC class Ib–restricted CD8⁺ T cells possess strong tumoricidal activities 的研究论文。烈冰生物参与了本研究中的单细胞测序和数据分析工作，下面我们一起了解一下本文的研究思路和结果解析部分～

发表日期：2023年10月

发表期刊：PNAS

影响因子：IF=11.1

实验设计

组织分选：小鼠脾脏和肿瘤的CD8⁺T细胞

单细胞捕获平台：10X Genomics

主要技术手段：

单细胞测序（scRNA-seq）、scTCR-seq、基因敲除实验、细胞转染，构建小鼠肿瘤模型、过继性免疫细胞疗法、流式细胞分选，细胞毒性试验、免疫组化等

Novelbrain云平台分析工具：

细胞聚类分析、subcluster分析、拟时序分析、GO功能富集分析、TCR分析

主要研究成果解析

1 MHC Ia可诱导Ib-CD8⁺ T细胞的抗肿瘤活性

将不同种类具有H-2^b背景的肿瘤细胞系分别接种到WT小鼠以及K^b−/−D^b−/−小鼠中，发现肿瘤可以在WT小鼠中生长，但在K^b−/−D^b−/−小鼠中几乎不存在，且K^b-/-D^b-/-小鼠中CD8⁺ T细胞的比例大幅度增加，而一些不表达MHC Ia的肿瘤细胞可以在K^b−/−D^b−/−小鼠中生长，没有诱导CD8⁺ T细胞的扩增；在排除了是由于MHC介导的排斥反应以及巨噬细胞、粒细胞、NK细胞的作用后，最终证明了MHC Ia可以有效地诱导Ib-CD8⁺ T细胞介导的抗肿瘤免疫反应。

2 单细胞转录组与单细胞TCR测序联合分析鉴定Ib-CD8⁺ T细胞的抗肿瘤特征

研究团队对携带B16F10（黑色素瘤）的K^b−/−D^b−/−小鼠（注射有Ia⁺ MSCs或Ia⁻ MSCs）的脾脏和肿瘤中的CD8⁺ T细胞进行scRNA-seq和scTCR-seq，为了保证后续分析的可靠性，研究者与烈冰的生信团队对数据进行严格的质控，最终共得到12208个细胞，通过聚类分析，得到13个细胞亚群, 并将其鉴定为4种类型，包括来自脾脏样本的Ia^-的 Naive T 、Ia⁺ 的Naive T和效应T细胞，来自肿瘤Ia⁺的效应记忆T细胞；

为了直接评估Ib-CD8⁺ T细胞的杀瘤作用，研究者从Ia⁺ MSC和Ia^- MSC处理的K^b−/−D^b−/−小鼠中分离肿瘤CD8⁺ T细胞，并与B16F10黑色素瘤细胞共培养，发现暴露于Ia⁺ MSCs的Ib-CD8⁺ T细胞更有效地杀死肿瘤细胞，且不表达耗竭T细胞的基因。

3 Ib-CD8⁺ T细胞在肿瘤部位的克隆扩增

通过scTCR-seq来表征K^b−/−D^b−/−小鼠脾脏和肿瘤中CD8⁺ T细胞的克隆性，结果表明，与脾脏相比，肿瘤中的Ib-CD8⁺ T细胞表现出明显的克隆扩增，并进一步分析了克隆扩增的TCR的CDR3长度、频率高的V、J基因片段。

4 Ib-CD8+ T细胞在脾脏和肿瘤中的演化关系

为了揭示Ib-CD8⁺ T的克隆关系，研究人员结合了来自同一只小鼠的脾脏和肿瘤CD8⁺ T细胞的scRNA和scTCR测序数据。结果中脾脏CD8⁺ T 细胞的cluster4与肿瘤Ib-CD8⁺ T细胞具有相似的特性, 而且，具有高TCR频率的前10个脾脏Ib-CD8⁺ T细胞克隆也集中在cluster 4中，表明具有杀瘤特性的Ib-CD8⁺ T细胞可能来源于特定的脾脏CD8⁺ T细胞。

拟时序（Pseudotime）分析表明，来自Ia⁺ MSCs处理小鼠的肿瘤CD8⁺ T细胞与脾脏CD8⁺ T细胞之间存在分化关系，并且在K^b−/−D^b−/−小鼠中，脾脏CD8⁺ T细胞在向杀瘤特性的CD8⁺ T细胞过渡的过程中开始表达细胞毒性基因。

为了进一步了解这些具有高细胞毒性特征的脾脏Ib^-CD8⁺ T细胞的特性，对已鉴定的marker基因进行了GO功能富集分析，发现cluster7中的细胞富含免疫突触形成的信号和T细胞激活的正调控信号, 并通过细胞实验对上述发现进行了验证。因此，在接受Ia⁺ MSCs后，K^b−/−D^b−/−小鼠脾脏Ib-CD8⁺ T细胞亚群被启动增殖并被赋予肿瘤杀伤能力。

5 MHC Ia通过Tbet激活Ib-CD8⁺ T细胞

为了进一步了解暴露于MHC Ia的Ib-CD8⁺ T细胞的抗肿瘤免疫作用，作者分析了Ia⁺ MSCs或Ia⁻ MSCs处理过的小鼠脾和肿瘤浸润的Ib-CD8⁺ T细胞的基因表达，发现Tbet及其相关信号通路显著上调。通过生成K^b−/−D^b−/−Tbet^−/−三基因敲除小鼠，作者进一步确定了Tbet在介导MHC Ia对Ib-CD8⁺ T细胞的启动效应中的作用。

6 Ib-CD8⁺ T细胞特异性表达CX3CR1基因

由于scRNA-seq数据显示，CX3CR1在表达Gzmb、Ifng和Gzma等杀肿瘤基因的Ib-CD8⁺ T细胞中表达，通过实验验证进一步证明，CX3CR1可被MHC Ia诱导，是具有杀瘤潜能的Ib-CD8⁺ T细胞的marker基因。

对携带肿瘤的WT小鼠的CD8⁺ T细胞的scRNA和scTCR分析，结果显示，CX3CR1⁺ CD8⁺ T细胞确实存在于WT小鼠中，并且高表达细胞毒性因子；拟时序结果也表明，CX3CR1⁺ CD8⁺ T细胞位于脾脏CD8⁺ T细胞和肿瘤浸润的细胞毒性CD8⁺T细胞的过渡节点上。最后，对已发表的人类黑色素瘤样本数据进行分析，也证明了CX3CR1⁺ Ib-CD8⁺ T细胞的存在，并可能在抗肿瘤免疫中发挥重要作用。

全文总结:

本研究通过单细胞转录组与单细胞TCR测序联合分析，首次揭示了以CX3CR1基因表达为特征的Ib-CD8⁺ T细胞在被MHC Ia启动后以Tbet依赖的方式优化TCR激活，从而获得很强的杀瘤能力，在肿瘤免疫治疗的发展中具有很大的前景。

原文链接：https://doi.org/10.1073/pnas.2304689120