椎间盘退变是自然衰老过程中常见的过程，会导致严重的脊柱症状，特别是腰痛，已成为全球造成残疾的主要原因。椎间盘是由凝胶状髓核（Nucleus pulposus，NP），外层多层胶原纤维交织的纤维环（Annulus Fibrosus，AF）和椎体上下软骨终板（Cartilage Endplates, CEPs）组成的一个特殊的相对密闭的组织。先前研究表明，髓核（NP）退变是导致椎间盘退行性变（IVDD）和腰痛的主要原因，髓核细胞（NPCs）的分化在IVDD的进展中起着重要作用。然而，异质NPCs的详细亚群和细胞类型特异性生物标志物仍有待阐明。

（图片来源：Fei Yang, et al., RSC Advances，2018）

        本期，小编就来介绍一下烈冰生物合作伙伴中山大学附属第一医院脊柱外科王建儒/郑召民教授团队发表在《Nature Communications》的文章，题目为“Serglycin secreted by late-stage nucleus pulposus cells is a biomarker of intervertebral disc degeneration”。这篇文章利用单细胞测序技术，发现了Serglycin(SRGN)，一种糖蛋白，是椎间盘退变（IVDD）的潜在生物标志物，可能有助于椎间盘退变诊断和治疗的发展。

发表日期：2023年12月

发表期刊：Nature Communications

影响因子：IF=16.6

烈冰生物参与了本研究中的单细胞测序和数据分析工作，下面我们一起了解一下本文的研究思路和结果解析部分。

实 验 设 计

样本信息

轻度退变椎间盘（MDD）：2男2女

重度退变椎间盘（SDD）：1男2女

样本组织

接受椎间盘切除术的患者的髓核组织（NP）样本

单细胞捕获平台

10X Genomics

主要技术手段

单细胞测序（scRNA-seq）、RNA测序、细胞培养、小鼠模型、免疫组化技术、免疫荧光技术、ELISA免疫检测、siRNA转染等

Novelbrain云平台分析工具

差异基因表达分析、Go/KEGG分析、细胞通讯分析、QuSAGE基因表达定量分析、ssGSEA基因富集分析、拟时序分析

主要研究成果解析

01 单细胞测序初步分析与NPCs细胞类型确认

研究者对7例接受椎间盘切除术的患者的髓核组织（NP）样本进行了单细胞测序，根据Pfirrmann分级标准，将患者分为分为轻度（I-II级）和重度（III-V级）退行性NP组织。通过scRNA-seq来研究IVDD患者NPCs的亚群分类和基因表达特征。为了保证后续分析的可靠性，研究者与烈冰的生信团队对数据进行严格的质控，最终得到55,264个细胞。通过UMAP聚类和细胞类型注释分析，得到9个大类，分别为髓核细胞（NPCs）、T细胞、B细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、内皮细胞、平滑肌细胞（SMCs）和红细胞。通过髓核细胞的Marker基因表达（SOX9和ACAN）和功能分析对NPCs进行细胞重聚类，鉴定了6种NPCs亚群：分别为Pro-NPCs、Fibro-NPCs、IR-NPCs、Met-NPCs、Adh-NPCs、SR-NPCs。

02 退变晚期NPCs及其标记基因SRGN的鉴定

为了研究NPCs亚群在IVDD过程中的功能作用，对6个NPCs亚群进行了拟时序分析，结果表明，Pro-NPCs处于拟时序的初始阶段，而Fibro- NPCs处于拟时序的末端，主要分布在髓核细胞退变进程的末期；同时，分析MDD和SDD NP组织中各细胞类群的比例，Fibro- NPCs也主要分布在重度退变椎间盘（SDD）组，与IVDD密切相关。GO富集分析显示，Fibro- NPCs参与了NPCs的胶原纤维和细胞外基质（ECM）组织。先前研究表明，FBNL1（Fibro- NPCs的标记基因）也参与了胶原纤维、ECM组织和细胞命运（如细胞凋亡和衰老）。因此，结合scRNA-seq、拟时序分析和GO富集分析的结果，研究团队把Fibro- NPCs定义为退变晚期髓核细胞。

为了识别退变晚期NPCs的标记基因，采用scRNA-seq分析，结果显示SDD组的SRGN基因表达增强，特别是在退变晚期NPCs中。此外，RNA测序结果显示SRGN在SDD组中表达上调，并与IVDD相关的基因marker呈正相关。为验证上述结果，H&E染色、IF染色、Western blotting的结果共同证实了退变晚期髓核细胞的鉴定，证明了高表达SRGN的退变晚期NPCs在IVDD进展过程中起重要作用。

03 SRGN与IVDD进展密切相关

     为了验证SRGN在IVDD中的关键作用，研究团队构建了SRGN敲除小鼠，通过MRI、micro-CT等检查以及H&E、Safranin-O、Sirius red和 IF 染色等组织免疫学检验，表明抑制SRGN可以有效地缓解IVDD的进展。由于局部炎症反应是引起IVDD的主要原因之一，因此作者研究了退变晚期NPCs中SRGN过表达与局部炎症反应之间的相关性。通过拟时序分析结果以及组织学检测等方法，表明SRGN在IVDD的局部炎症反应中发挥了重要作用，退变晚期NPCs中SRGN升高，加重了炎症反应。

04 SRGN促进炎症细胞因子的分泌

为了进一步了解SRGN在IVDD过程中调控局部炎症反应的机制，从RNA-seq数据中对SDD中前20个上调的基因进行了KEGG分析，结果表明NF-kB信号通路富集。基因集合富集分析（GSEA）结果进一步表明，退变晚期NPCs与NF-kB信号通路密切相关。通过Western Blot、ELISA检测、IF染色等验证，都显示NF-kB信号通路参与了SRGN介导的对IVDD期间退变晚期NPCs局部炎症反应的调控。

05  SRGN增加了巨噬细胞的浸润

先前研究表明巨噬细胞在IVDD中发挥重要作用。为了研究巨噬细胞在调节局部炎症反应中的作用，研究团队通过基因表达（CD16和CD68）和功能分析对巨噬细胞进行分类。对巨噬细胞进行单独UMAP分析，形成3个细胞亚型，cluster 0（TNF+巨噬细胞）、cluster 1（VENTX+巨噬细胞）和cluster 2（MARCO+巨噬细胞），细胞占比分析显示，SDD组中TNF+巨噬细胞的比例更高，CD11c+和CD86+是M1巨噬细胞的标记物，主要分布于TNF+巨噬细胞中。对3个巨噬细胞亚型进行QuSage基因集合定量分析显示，TNF+巨噬细胞中炎症细胞因子和促炎基因集的表达显著上调。随后，对TNF+巨噬细胞和NPCs进行CellPhoneDB分析，结果显示，与退变晚期NPCs相比，TNF+巨噬细胞中TNF-α、CCL3和IL-1β的配体和受体对显著增加。最后，细胞实验验证也证明了高表达SRGN的退变晚期NPCs通过促进巨噬细胞浸润和M1巨噬细胞极化，加重了局部炎症反应。

06 瑞香素（DAP）可减轻局部炎症反应

研究团队尝试寻找能通过调节局部炎症反应来有效缓解IVDD的药物或化合物，使用AlphaFold2软件来预测SRGN的结构并评估其可靠性，发现DAP能有效地与SRGN结合，细胞热位移实验（CETSA）也表明，DAP在体内可以与SRGN结合。因此，研究团队通过多种方法验证了DAP通过抑制体内SRGN的表达来减轻局部炎症反应，缓解IVDD进展。

总 结

本研究采用单细胞测序技术（scRNA-seq），通过比较分析和实验验证等技术手段，揭示了人椎间盘髓核细胞（NPCs）的异质性，并发现一群高表达SRGN的退变晚期髓核细胞在椎间盘退变中的关键作用，它可能成为IVDD临床前诊断的生物标志物和治疗手段；此外，作者还发现了瑞香素（DAP）可以有效地下调SRGN的表达，减轻IVD的局部炎症反应，可以作为IVDD的一种治疗选择。

原文链接：

https://www.nature.com/articles/s41467-023-44313-9