近日，烈冰合作伙伴浙江大学医学院附属妇产科医院许君芬团队在Cancer Letters上发表了题为“Single-cell transcriptomics reveals the aggressive landscape of high-grade serous carcinoma and therapeutic targets in tumor microenvironment”的文章。该研究通过scRNA-seq技术对高级别浆液性癌（HGSC）进行单细胞水平上的详细分析，发现了一种独特的S100A9⁺肿瘤细胞亚型，揭示了S100A9⁺肿瘤细胞亚群的异质性和TME中的细胞间相互作用，这些发现阐明了驱动HGSC侵袭性的机制。

发表日期：2024年5月

发表期刊：Cancer Letters

影响因子：IF=9.7

作为本研究的合作单位之一，烈冰生物参与了单细胞测序实验及数据分析的相关工作。

研究背景

高级别浆液性癌（HGSC）是卵巢癌中最常见和最致命的亚型，大约占所有卵巢癌病例的70%。肿瘤微环境（TME）在HGSC转移中起着重要作用。单细胞测序技术的不断发展，结合功能验证实验，为改善HGSC和其他亚型卵巢癌的诊断、预后和治疗带来了新的视角。尽管已有一些研究揭示了HGSC的分子机制，但控制HGSC转移的复杂机制仍然不完全清楚。因此，在本研究中作者利用单细胞RNA测序技术（scRNA-seq）进一步探究了原发性HGSC和不同转移部位之间的异质性。

实验设计

采样组织：18位HGSC患者（新诊断、未接受治疗）的34个肿瘤样本（包括原发性HGSC肿瘤、腹水、腹网膜转移、脾脏转移、腹膜转移和淋巴结转移部位）

单细胞捕获平台：10X Genomics

主要技术手段：单细胞测序、裸鼠异种移植模型、细胞代谢分析等

烈冰Novelbrain云平台分析工具：细胞聚类分析、SubCluster分析、SCENIC转录因子分析、拟时序分析、KEGGpathway、基因差异表达分析等

主要研究结果解析

01、肿瘤微环境（TME）的单细胞分析

研究者对18位HGSC患者的34个肿瘤样本（包括原发肿瘤和转移部位）进行了单细胞RNA测序，为了保证后续分析的可靠性，研究者与烈冰的生信团队对数据进行严格的质控，通过UMAP聚类和细胞类型注释分析，识别了23个不同的细胞cluster，共计109,573个细胞，并将其鉴定为8种主要的细胞类型，包括上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞、树突细胞、单核细胞、浆细胞、B细胞和T细胞。其中，T细胞是大部分HGSC样本的主要组成细胞类型，且与临床解剖结果相似，但淋巴结转移样本会相对富集B细胞，其他细胞类型在不同转移部位的组成存在差异。这暗示着HGSC肿瘤细胞在不同部位形成复杂的免疫微环境。

02、S100A9+肿瘤细胞亚型的发现

为了进一步表征肿瘤细胞的详细亚群，研究者对原发性HGSC肿瘤细胞进行细胞重聚类分析，发现了10个肿瘤细胞亚群，根据特定的标记基因将其进一步细分为6个功能亚群，包括S100A9⁺肿瘤细胞、CXCL10⁺的EMT特性肿瘤细胞、EMT特性的肿瘤细胞、TFF3⁺肿瘤细胞、TPPP3⁺肿瘤细胞和细胞周期特性的肿瘤细胞。S100A9+肿瘤细胞高表达一系列基因，包括S100A8、S100A9、ADGRF1、CEACAM6、CST6、NDRG2、MUC4、PI3、SDC1和C15orf48。

使用TCGA数据库的HGSC临床预后数据集分析不同基因特征的肿瘤亚群，结果表明，与其他五种肿瘤亚型相比，S100A9⁺肿瘤细胞含量高的初治患者总生存期明显较差。接下来，研究者对S100A9⁺肿瘤细胞基因富集Pathway分析，发现该亚群较其他亚群高响应铂耐药通路。更重要的是，借助SCENIC分析找到调控该亚群的重要转录因子——MAFB，MAFB调控多个信号通路，如PI3K/AKT、MAPK和HIF-1信号通路。此外，S100A9⁺肿瘤亚群广泛存在于转移组织，且占比较高。研究者推测，S100A9⁺肿瘤细胞亚型可能在HGSC的形成及其转移中发挥重要作用。

03、S100A9+肿瘤细胞在HGSC转移过程中的特征

S100A9⁺肿瘤亚群不仅存在于原发性HGSC，也广泛分布于不同转移灶HGSC，研究者进一步探究该亚群在不同部位的差异与共性。通过对所有S100A9⁺肿瘤细胞进行细胞聚类分析，发现9个不同的亚群，根据它们的marker基因表达将这些亚群归类为3个功能亚群。相关性分析揭示了S100A9⁺肿瘤细胞中形成了三个共功能亚群：C0_C6_C8、C1_C2_C4和C3_C5_C7。三个亚群在不同部位的组成存在差异，研究者推测三亚群的功能可能与其富集特定转移部位相关。通过分析TCGA卵巢癌数据集，其中，C1_2_4亚群在大网膜转移灶中富集，该群具有较差的HGSC生存期。拟时序分析进一步揭示了三个亚群之间的关系，推断它们可能分化的路径，如C3_5_7亚群可能分化为C1_2_4或C0_6_8亚群。此外，对不同亚群的特征基因进行功能分析，揭示了它们在不同生物学通路中的激活情况。

04、验证S100A9+肿瘤细胞特征基因的功能

为了研究S100A9⁺肿瘤细胞亚型中特征基因的功能，研究者设计了特定的siRNA针对这些基因进行敲除，发现敲除这些基因后卵巢癌细胞的集落形成能力、迁移和侵袭能力显著下降。为了验证体外实验的发现，研究者在裸鼠模型中进行了体内实验，发现敲除任何这些十个基因都导致了卵巢癌结节的大小和肿瘤重量显著减少，其中S100A9、S100A8或NDRG2的敲除效果最为明显。通过体外和体内实验表明，S100A9⁺肿瘤细胞亚型的特征基因在卵巢癌细胞的生长和侵袭中起着至关重要的作用。

05、CAFs和TAMs在HGSC中的重要作用

研究者发现了一种特定的肿瘤相关成纤维细胞（CAFs）亚群，称为HK2⁺_CAFs，其特征是高表达己糖激酶2（HK2），这表明它们参与了肿瘤代谢。研究者利用TCGA RNA-seq数据进一步分析了HK2⁺_CAFs的marker基因，发现HK2⁺_CAFs含量高的患者总生存期明显较短。基因富集分析KEGG通路显示，HK2⁺_CAFs在缺氧反应、药物反应、糖酵解过程、糖异生、血管生成和细胞迁移等方面富集。差异基因表达分析发现，特定基因如SLP1、VEGFA、HP、PLA2G2A、CFB和MT1G在HK2⁺_CAFs中高度表达。此外，研究者发现该CAF亚群的主要转录因子为KLF5。实验验证显示，KLF5的敲除可以降低HK2的表达，并抑制卵巢癌细胞的迁移和侵袭。

TAMs在肿瘤的进展中扮演重要角色，与CAFs类似，研究者发现免疫抑制肿瘤相关巨噬细胞（TAM）亚型通过转录因子PPARG调控进行糖脂代谢重编程，促进肿瘤转移。

全 文 总 结

本研究通过单细胞转录组学的方法，鉴定了一种独特的S100A9⁺肿瘤细胞亚型，存在于HGSC原发性和转移部位，与较差的总生存率密切相关，并且高表达一系列特征基因。研究者通过体外和体内模型验证，发现这些特征基因的单独敲除显著抑制了卵巢癌的生长和侵袭。此外，研究还揭示了肿瘤微环境中的代谢特征。这些发现提供了HGSC肿瘤细胞和肿瘤微环境之间相互作用的新见解，为开发针对HGSC的新疗法提供了关键见解。

本研究详细信息参见原文链接：https://doi.org/10.1016/j.canlet.2024.216928