肠道和肾脏本是井水不犯河水的两个领地。但今天，我们要揭秘一场跨越肠道与肾脏的秘密行动——一场由肠道的“隐形侠”CXCR6⁺ ILC3s领衔的“迁徙大戏”。它们携带着PD-1的神秘力量，悄无声息地潜入肾脏，摇身一变成为加剧纤维化的“破坏者”…

2024年5月29日，中山大学附属第一医院周怡教授、陈崴教授及哈佛医学院布莱根妇女医院Joseph V. Bonventre教授共同通讯（梁州、唐子雯、朱昌健为论文共同第一作者）合作在Immunity（IF=32.4）上发表了题为“Intestinal CXCR6+ ILC3s Migrate to the Kidney and Exacerbate Renal Fibrosis via IL-23 Receptor Signaling Enhanced by PD-1 Expression”的文章。研究团队揭示了肾脏纤维化肠道中的CXCR6+ ILC3s从肠道到肾脏的迁移途径，以及肾脏中表达PD-1的ILC3s通过调节IL-23受体内吞，增强IL-17A的产生，从而加剧纤维化。

烈冰生物参与了本研究的单细胞测序和生物信息数据分析工作。

下面，让我们跟随这篇文献，探索肠道与肾脏之间的隐秘联系以及肾脏纤维化治疗的新思路！

研 究 背 景

      在人体的浩瀚免疫系统中，有一群神秘的战士——先天淋巴细胞（ILCs），它们是免疫反应的先锋，快速响应外界威胁，保护我们的健康。ILCs家族中，ILC3s尤为特殊，它们不仅在维护粘膜屏障的稳态中扮演着重要角色，还与组织修复、抗细菌感染以及肿瘤免疫监视等生理和病理过程密切相关。最新研究发现，ILC3s在肝脏纤维化中也扮演着关键角色。但是，ILC3s是否参与肾纤维化尚不清楚，而肾脏纤维化是几乎所有慢性肾病（CKD）的共同结局，研究ILC3s在肾脏纤维化中的作用对于肾脏疾病的治疗十分必要。

单细胞实验设计

单细胞实验分组：

不同疾病阶段：

1）UUO处理0d 小肠（steady state (pre-migration)）

2）UUO处理3d 小肠（mobilization state (post-migration)；

UUO处理3d 肾脏（early fibrosis）

3）UUO处理14d 肾脏（late fibrosis）

处理：分选小肠和肾脏中的ILCs细胞

单细胞捕获平台：BD Rhaphsody

主要技术手段：单细胞RNA测序（scRNA-seq）、基因工程小鼠模型、ELISA、免疫荧光染色、流式细胞术等
烈冰Novelbrain云平台分析工具：细胞聚类分析、SubCluster分析、拟时序分析、基因差异表达分析等、KEGG分析等

主要研究结果解析

01 IL3s在肾脏纤维化中的积累

      研究团队发现在CKD患者和小鼠模型中，肾脏纤维化的程度与肾脏和血液中ILC3s的增加有关。研究者首先通过免疫荧光染色分析了CKD患者肾脏活检样本中的ILC3s，发现它们主要位于纤维化区域，并且与α-SMA（纤维化指标）表达呈正相关。接着通过流式细胞分析，证实了在CKD患者中，肾脏和外周血中ILC3s的比例显著升高。

      为了进一步表征ILC3s，研究团队建立了两种经典的肾纤维化小鼠模型：UUO（单侧输尿管梗阻）和FA（叶酸）诱导，发现肠道ILC3s能够迅速迁移到受损的肾脏。通过免疫荧光和流式细胞术的分析，研究者发现这些ILC3s在肾脏中的积累与肠道中ILC3s的减少相对应，表明了肠道到肾脏的迁移。

02 单细胞测序助力揭示ILC3s迁移的机制

      研究团队通过scRNA-seq分析了来自不同疾病阶段UUO小鼠的肾脏和肠道ILCs。为了保证后续分析的可靠性，研究者与烈冰的生信团队对数据进行严格的质控，最终获得了8,294个肾ILC3s细胞和7,288个肠ILC3s细胞。研究者使用UMAP聚类分析区分不同的ILCs细胞亚群，接着对ILC3s进行拟时序分析，结果表明，肠道细胞主要停留在运动轨迹的初始阶段，表明它们可能来源于肠道并迁移到肾脏。然后分成两个不同的分支—一个向肾ILC3s发展，另一个维持肠道基因表达，表明它们可能来源于肠道并迁移到肾脏。研究者进一步分析了肾脏和肠道ILC3s中趋化因子受体的基因表达，发现都高表达CXCR6和CXCR4，暗示这些受体在ILC3s迁移中起关键作用。

此外研究者观察到肾脏纤维化小鼠模型和CKD患者中，受损肾小管的CXCL16组织表达和血清中可溶性CXCL16 (sCXCL16) 水平均升高，表明肠道CXCR6+ILC3s的迁移可能是由肾脏表达和释放CXCL16而进入循环所驱动的。进一步的，研究者通过药理阻断实验、CXCR6缺陷小鼠模型、Kaede转基因小鼠模型等实验证明了肠道ILC3s通过CXCR6-CXCL16信号传导迁移到受损肾脏，并可能在肾脏纤维化过程中发挥作用。

03 ILc3s促进肾脏纤维化

研究团队使用Rorc-/-小鼠模型（缺乏RORγt，这是ILC3s和Th17细胞所必需的），通过骨髓移植实验，研究者发现在缺乏ILC3s的情况下，肾脏纤维化程度减轻。在所有模型中，肾脏中ILC3s的空间组织和数量与纤维化微环境的大小正相关。接着，将分离的肠道ILC3s通过静脉注射到Rag1-/-小鼠中，研究者发现肾脏中ILC3s的数量显著增加，并在缺乏适应性淋巴细胞的情况下加剧了肾脏纤维化。这些结果表明ILC3s在肾脏纤维化中起着重要的促进作用，并且它们通过形成纤维化微环境直接影响肾脏成纤维细胞的活化和ECM的产生。

04 PD-1表达的调控作用

      通过单细胞测序数据，研究者发现在纤维化肾脏中，PD-1阳性的ILC3s与CXCR6的共表达显著，表明新迁移到肾脏的CXCR6+ ILC3s表达了PD-1。使用Pdcd1-/-（PD-1基因敲除）小鼠模型，研究者发现PD-1缺失并不损害ILC3s的迁移能力。将Pdcd1-/-或WT（野生型）小鼠的纯化肠道ILC3s转移到UUO（单侧输尿管梗阻）模型的受体小鼠中。研究结果表明PD-1表达增强了ILC3s的促纤维化作用。进一步通过实验验证表明，PD-1阳性ILC3s在肾脏纤维化的发展中可能起到关键的促进作用。

05 PD-1在ILC3s中的作用

为了深入了解PD-1+ ILC3s对肾纤维化的影响机制，研究者从Pdcd1-/- UUO3d肾脏中分离了CD45+LIN-CD127+ ILCs，用于scRNA-seq。结果表明，与WT-ILC3s相比，Pdcd1-/-ILC3s中 IL-17A基因表达下降，表明PD-1缺失导致IL-17A产生减少。随后分析证实，与肠道ILC3s相比，肾脏ILC3s能够产生大量的IL-17A，并且PD-1阳性ILC3s的IL-17A分泌能力增强。接着，小鼠模型等功能实验共同表明，PD-1+ ILC3s通过产生IL-17A直接促进肾脏成纤维细胞的扩张和活化。最后，通过结构预测和共免疫沉淀等实验，研究者发现PD-1可能与IL-23R发生物理相互作用。这种相互作用可能通过竞争性结合IL-23R，抑制其内吞作用，从而维持IL-23R在细胞表面的表达。

全文总结

      本研究使用单细胞转录组测序技术以及大量的功能实验验证，提供了肠道ILC3s在肾脏纤维化中作用的新见解，即ILC3s通过CXCR6-CXCL16信号传导从肠道迁移到肾脏，揭示了PD-1在调节ILC3s促纤维化效应中的重要作用。这些发现为预防和治疗CKD提供了新的途径。

更多详细内容参考原文链接：

https://doi.org/10.1016/j.immuni.2024.05.004

烈冰助力肾脏相关文献

      烈冰已助力Immunity、Theranostics、Nature Genetics等在内的多篇肾脏高分文献发表。