烈冰助力 | Mil Med Res（IF = 16.7） 干扰素-α刺激DExH-box解旋酶58来预防肝细胞铁死亡

    烈冰生物合作伙伴中国人民解放军海军军医大学侯晋教授团队于2024年4月在《Military Medical Research》期刊发表了题为“Interferon-α stimulates DExH-box helicase 58 to prevent hepatocyte ferroptosis” 的研究论文。

   该研究利用单细胞测序等技术揭示了 DHX58 在肝脏缺血再灌注损伤 (I/R) 和铁死亡中的重要作用，即Dhx58 可与 Gpx4 mRNA 结合，并通过招募 YTHDC2 促进其翻译，从而提高 GPX4 蛋白水平并抑制铁死亡。此外，发现IFN-α 可刺激 Dhx58 表达，从而抑制肝脏 I/R 损伤和铁死亡，因此研究团队提出了 IFN-α 预处理作为肝脏 I/R 损伤的一种潜在治疗策略。烈冰生物参与了本研究中的单细胞测序数据分析工作。

发表日期：2024年4月

发表期刊：Military Medical Research

影响因子：IF= 16.7

一、研究背景及方法

1、研究背景

      细胞可以在多个信号调节通路的作用下以多种形式死亡，如凋亡、坏死、焦亡以及铁死亡等。其中，铁死亡相比于其他三种死亡形式，其特别之处在于铁依赖性脂质活性氧(reactive oxygen species，ROS)的积累。大量研究发现，谷胱甘肽过氧化物酶4(Glutathione Peroxidase 4，GPX4)可以作为判断细胞铁死亡的指标之一。

       肝脏 I/R 损伤是肝脏手术、创伤和战伤中常见的并发症。肝细胞铁死亡在肝脏 I/R 损伤中起着重要作用。DEAD/DExH 盒解旋酶 (DDX/DHX) 家族成员在 RNA 代谢中发挥关键作用，但其在肝细胞铁死亡中的作用尚不清楚。

2、实验设计

实验样本：

假手术处理以及I/R处理的Dhx58^f/f 组和 Dhx58^hep−/−组小鼠的肝脏组织制备单细胞悬液

单细胞捕获平台：

10 × Genomics

主要技术手段：

CRISPR/Cas9技术、单细胞转录组（scRNA-seq）测序、免疫共沉淀（Co-IP）、Western blotting等

NovelBarin云平台分析：

细胞聚类分析，QuSAGE分析，Pathway分析，细胞通讯分析等

二、主要研究结果解析

1、肝脏I/R损伤时过量的活性氧会降低DHX58 表达

      已有研究证明活性氧（ROS）的过量产生对于启动I/R损伤至关重要。在此基础上，该研究团队证实DDX/DHX家族成员Dhx58在肝脏I/R后，其表达水平显著降低。进一步的研究发现，H₂O₂能够致使肝细胞中DHX58的表达水平下降。然而，当使用NAC或BHA处理清除活性氧后，在肝脏I/R后DHX58表达水平的降低得以缓解，同时肝损伤也有所减轻。该结果明确显示，在肝脏处于I/R损伤的情况下，ROS会过度生成，进而导致肝细胞中DHX58的表达下调。

2、降低 DHX58表达促进肝脏铁死亡和 I/R 损伤

      为深入探究肝脏I/R损伤中 Dhx58 水平降低的潜在作用，研究团队成功构建了肝细胞特异性 Dhx58 基因敲除小鼠 Dhx58^hep−/−。研究发现，与Dhx58^f/f 组相比，Dhx58^hep-/-小鼠的肝脏在经历 I/R 损伤期间，呈现出更为严重的肝损伤（P<0.01），其血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（AST）水平显著更高（P<0.01），炎症细胞因子白细胞介素-6（IL-6）、IL-1β、单核细胞趋化蛋白 1（MCP1）的 mRNA 水平也明显升高（P<0.05）。

       接下来对经过假手术处理或者I/R处理的Dhx58^f/f 组以及 Dhx58^hep-/-组小鼠的肝脏组织进行单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）。为了确保后续分析的可靠性，研究者与烈冰的生物信息学团队合作进行数据分析。最终，肝内细胞共鉴定出10 个主要的细胞类型，其中肝细胞的数量最多。

       进一步对 I/R 处理后的 Dhx58^f/f 组和 Dhx58^hep-/-组小鼠肝脏组织的 scRNA-seq 数据进行分析，共鉴定出 17 个主要的细胞类型。通过 QuSAGE 分析结果表明，在 I/R 之后，肝细胞的亚群如肝细胞_c01、肝细胞_c06、肝细胞_c09 以及肝细胞_c13 均呈现出铁死亡富集。

       然后对肝细胞重新聚类分为了10个细胞亚群，QuSAGE分析显示，Dhx58^hep-/-组小鼠肝脏中显著富集的肝细胞_c00和c01亚群均呈现出铁死亡富集，Pathway分析也验证了这一结果。

       细胞通讯分析表明肝细胞_c00、c01亚群与中性粒细胞和单核细胞之间可能存在相互作用。以上scRNA-seq数据分析结果表明，Dhx58^hep-/-可能在肝脏 I/R 损伤期间增强肝细胞中的铁死亡。

3、DHX58通过募集 YTHDC2增强 Gpx4 mRNA 翻译

      接着，研究团队对 Dhx58^f/f 和 Dhx58^hep-/-组小鼠肝脏进行蛋白质组学筛选，同时利用 DHX58 抗体进行 RNA 免疫共沉淀测序(RIP-seq)，并结合文献检索、RIP-qRT-PCR 等方法。最终确定 Gpx4 在 Dhx58^f/f 和 Dhx58^hep-/-组小鼠肝脏之间呈现差异表达，且其 mRNA 水平与 DHX58 具有稳定的相关性。进一步分析表明，DHX58 通过与 Gpx4 mRNA 结合，进而增加其蛋白水平，从而抑制肝脏铁死亡。

      为了阐明 DHX58介导的促进 Gpx4 mRNA 翻译的机制，研究团队利用免疫共沉淀方法、质谱（mass spectrometry，MS）和m6A 免疫沉淀和测序（m6A immunoprecipitation and sequencing，MeRIP-seq）等方法发现DHX58 招募 YTHDC2 可以通过促进 Gpx4 mRNA 的 m6A 依赖性翻译来提高 GPX4 蛋白水平，进而抑制肝脏铁死亡。

4、干扰素 -α 刺激 DHX58预防肝脏铁死亡

      DHX58属于典型的干扰素刺激基因（ISG），已有研究证实，干扰素-α（IFN-α）能够上调 Dhx58 基因的表达。研究团队观察到，对小鼠进行腹腔注射 IFN-α 后，DHX58 以及 GPX4 蛋白水平得以提升，同时肝脏铁死亡以及肝脏损伤受到抑制。然而，在 Dhx58hep-/-小鼠中，IFN-α 的预防作用消失。由此可以确定，IFN-α 处理能够刺激 DHX58 表达，进而防止肝脏铁死亡。

三、研究结论

      该研究利用单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）等技术，发现肝脏 I/R 损伤时 ROS 过度产生会降低 DHX58 基因的表达，DHX58 下调使 GPX4 表达下降进而促进铁死亡和肝脏损伤加重。 IFN-α 处理可上调 DHX58 表达，DHX58 通过与 m6A 读取器 YTHDC2 相互作用可促进 Gpx4 mRNA 的翻译，从而提高 GPX4 蛋白水平并抑制铁死亡，缓解肝脏损伤。该研究提供了IFN-α刺激DHX58促进m6A修饰Gpx4 mRNA翻译的机制证据，表明IFN-α在预防肝I/R损伤期间肝铁死亡方面具有潜在的临床应用价值。

原文链接：

DOI: 10.1186/s40779-024-00524-9