空转+单细胞核测序助力“肌内脂肪生成机制”探索

      烈冰生物合作伙伴中山大学生命科学学院莫德林教授团队于2024年10月在《Sci China Life Sci》期刊发表了题为“Integrating spatial transcriptomics and single-nucleus RNA-seq revealed the specific inhibitory effects of TGF-β on intramuscular fat deposition” 的研究论文。

      该研究通过整合空间转录组学和单核RNA测序技术，发现肥胖猪的肌内脂肪（IMF）中存在内皮细胞来源的TGF-β1，而瘦肉型猪则主要表达纤维脂肪生成祖细胞（FAPs）自身产生的TGF-β2。TGF-β可抑制IMF形成并延缓肌肉修复，而TGF-β抑制剂则加速肌肉修复。本研究揭示了IMF形成的分子机制，为开发治疗肌肉萎缩和改善肌肉功能的新策略提供了理论基础。烈冰生物参与了本研究中的空间转录组测序和单细胞核测序实验以及数据分析工作。

发表日期：2024年10月

发表期刊：Science China. Life sciences

影响因子：IF= 8.0

研究背景及方法

1、研究背景

      肌肉萎缩是肥胖、糖尿病等疾病常见的并发症，而 IMF 的异常沉积会进一步加剧肌肉功能障碍。FAPs 是 IMF 形成的关键细胞，但其分化机制尚不清楚。已有研究表明转化生长因子-β (TGF-β) 在肌肉萎缩和纤维化中发挥重要作用，但其对 IMF 形成的影响仍存在争议。

2、实验设计

实验样本

空间转录组测序：

180日龄约克夏猪（瘦肉型猪，YK）的背最长肌（LD）组织，n=1

180日龄格洛斯特花猪（肥胖型猪，GS）的LD组织，n=1

单细胞核 RNA 测序（snRNA-seq）：YK和GS猪的LD冷冻包埋组织（与空转同一块组织）

单细胞核捕获平台：烈冰生物 10 × Genomics

主要技术手段：空间转录组测序、单细胞核测序、RNA-seq等

NovelBarin云平台分析：细胞聚类分析，拟时序分析，Pathway分析，细胞通讯分析等

主要研究结果解析

1. 不同IMF含量的猪背最长肌的空间转录组学研究

     研究者通过对猪LD进行油红O染色（脂肪染色）和Masson染色（结缔组织染色），发现研究者通过对猪LD进行油红O染色（脂肪染色）和Masson染色（结缔组织染色），发现GS猪的LD中IMF的分布比YK猪的更广泛，胶原蛋白在IMF附近沉积。对 YK 和 GS 各20头猪的屠宰测定统计也显示GS 猪的体脂率和肌肉脂肪含量明显高于YK猪。

   研究团队通过对180日龄YK猪和GS猪的LD组织进行空间转录组学分析，共捕获到6152 个位点；标准化后总reads数为 776,590,805，平均每个位点的reads数为 126,234。每个位点的中位UMI数为 398，每个位点的中位基因数为 222。

   接着研究者利用 Spatial Seurat 将两个样本中捕获的位点分为六组（P0、P1和P4，Ⅱ 型肌纤维；P2和P5，Ⅰ 型肌纤维；P3，脂肪细胞），其中 P3 代表肌内脂肪细胞组。对所有位点进行UMAP降维，分为六个聚类。发现YK猪的 P3 聚类明显小于GS猪。空间转录组学分析结果表明，两种类型猪IMF的空间分布存在显著差异。

2. snRNA-seq鉴定出一个肌内前脂肪细胞群

   接下来，研究团队从与空间转录组测序分析所使用的同一块剩余组织中提取细胞核，并进行 10×Genomics 单细胞核 RNA 测序（snRNA-seq）。共捕获了 19055 个细胞核（YK猪，9810个；GS猪，9245个），鉴定出17个细胞簇（1、5、6细胞簇由 4736 个 Ⅰ 型肌细胞核组成；0、2、3、4、7、8细胞簇由11060 个 Ⅱ 型肌细胞核组成；9、10细胞簇1482 个前脂肪细胞 / 周细胞细胞核组成；11细胞簇包含649 个骨骼肌细胞核；12细胞簇包含629 个内皮细胞核；13细胞簇包含30 个 T 细胞 / 巨噬细胞核；14细胞簇包含 121 个肌肉卫星细胞核；15、16细胞簇包含48 个双联体）。

   结果表明，GS 猪的前脂肪细胞比例高于YK 猪。对前脂肪细胞簇进行通路分析后发现，PI3K - AKT 和 TGF - β信号通路高度富集，这两个信号通路在前脂肪细胞的脂肪生成过程中发挥着关键作用。

      研究者对 9 号和 10 号细胞簇进行了重新聚类，根据标记基因表达共分为八个簇：C0、C1、C2、C3、C4 和 C6细胞簇定义为前脂肪细胞，C5 细胞簇定义为周细胞，C7 细胞簇定义为脂肪细胞。UMAP 降维分析显示周细胞与脂肪细胞相关细胞距离不同。对前脂肪细胞和脂肪细胞进行拟时序分析显示，前脂肪细胞簇中有两条分化途径。分析表明YK猪背最长肌周细胞更多，GS猪肌肉中 FAPs 更多，具有更大脂肪生成潜力。

3. 将snRNA-seq获得的细胞信息映射到空间转录组学数据

   研究者将通过单核 RNA 测序（snRNA-seq）获得的细胞聚类结果信息映射到空间转录组学数据中，并对其重新分类为 6 个簇。脂肪细胞标记基因（ADIPOQ、PLIN1 和 FABP4）在 P3 中高表达。FAP标记基因PDGFRA在GS 猪的背最长肌中分布更为广泛且表达水平更高，这与 snRNA-seq 的分析结果相一致。

   此外，研究者还发现几种细胞外间质（ECM）相关基因在 GS 猪的 IMF 中的表达显著高于YK 猪。标记基因分析显示，YK 猪的 IMF 生成程度远低于 GS 猪，这与 snRNA-seq 数据的拟时序分析结果一致。以上研究结果表明，IMF 沉积越多，ECM 积累也会越多。

4. snRNA-seq分析鉴定了TGF-β和PI3K/AKT信号通路在IMF中特异性富集

        PI3K/AKT 通路是胰岛素信号下游的经典通路，可促进前脂肪细胞的脂肪生成分化。而TGF-β 通路可以抑制脂肪生成。研究者利用 GSEA 分析每个位点的通路富集情况，发现 PI3K/AKT 和 TGF-β 这两个功能相反的信号通路在 IMF 中特异性富集。并且两种猪肌肉组织代谢模式不同，YK 猪的肌肉以糖酵解为主，而 GS 猪则以氧化磷酸化为主。

   基因表达分析结果表明，两种品种猪的前脂肪细胞簇中的 TGFB1 表达水平无显著差异，而YK 猪 IMF 中的 TGFB2 表达显著高于GS 猪，与snRNA-seq结果相一致。

   接下来研究者对前脂肪细胞簇的基因集进行通路富集分析，结果显示在 C2和 C3 亚群中，PI3K/AKT 信号通路中的基因富集比 TGF-β 信号通路中的基因富集更多，而在 C1和 C4 亚群中富集情况相反。

      为了明确这两种信号通路在脂肪分化过程中的具体功能，研究者运用 PI3K/AKT 和 TGF-β 通路的抑制剂或激动剂开展体外脂肪形成诱导实验。实验结果显示，激活 PI3K/AKT 途径能够促进胚胎成纤维细胞的脂肪形成以及成肌细胞的肌源性表型。该结果表明，PI3K/AKT 通路在 IMF 中并非起到特定作用，而只是在 IMF 沉积后呈现高度富集状态。

而对于 TGF-β 通路的研究结果表明，激动 TGF-β 会显著降低脂滴的形成，而阻断 TGF-β 通路则增强了脂滴形成。以上结果显示，TGF-β 可以抑制脂肪生成，阻止异常 IMF 的产生和积累。

5. GS猪（肥胖型猪）IMF中的TGF-β1来源于内皮细胞

   接下来，研究者进行细胞通讯分析。结果发现，在 IMF 含量较低的 YK 猪中，前脂肪细胞自分泌的 TGF-β2 通路介导了大多数 TGF-β 相关的细胞间相互作用。而在 IMF 含量较高的 GS 猪中，细胞间通讯主要通过内皮衍生的 TGF-β1 向前脂肪细胞的转运。一种可能的解释是，GS 猪的 IMF 通过旁分泌途径从内皮细胞接收 TGF-β1，从而抑制 IMF 积累。尽管 YK 猪和 GS 猪之间的内皮细胞数量并没有显著差异，但 YK 猪内皮细胞中 TGFB1 的表达显著低于 GS 猪，而两种品种猪内皮细胞中 TGFB2 的表达则没有显著差异。以上结果表明，肥胖型猪 IMF中的TGF-β1来源于内皮细胞。

   这表明GS 猪的内皮细胞受到 TGF-β1 的旁分泌作用。原因可能在于 GS 猪较为肥胖且 IMF 含量高，与 YK 猪相比，其 IMF 中 TGF-β2 的表达量相对较少，所以需要额外的内皮衍生 TGF-β1 来抑制 IMF 的沉积。相反，YK 猪较瘦，因此无需进行全身的 TGF-β1 动员。同时，IMF 也会分泌 TGF-β2，这或许足以抑制过度沉积。

6. TGF-β1对脂肪生成的抑制作用强于 TGF-β2

   接下来，研究者对公共数据库（GSE135134、GSE164471）中的人脂肪和肌肉组织的 RNA-seq 数据进行了分析。发现在 53 个人类肌肉组织中，TGFB1与成熟脂肪细胞标志物 ADIPOQ 表达呈正相关，但与前体脂肪细胞标志物 PDGFRA 的表达无显著相关性。TGFB2 与 ADIPOQ 和 PDGFRA 的表达均呈正相关，这提示 IMF 仅与前脂肪细胞中的 TGFB2 相关。

   在434份人类皮下脂肪组织样本中，TGFB1和 TGFB2与脂肪形成标记基因 ADIPOQ 和 FABP4均呈显著负相关。这表明 TGFB1和 TGFB2在肌肉和正常脂肪组织中是表达相反的标志物，这可能因为IMF 累积是由于异常脂肪沉积。进一步的体外实验验证结果表明在成熟脂肪细胞中，TGF-β1对脂肪生成的抑制作用强于 TGF-β2。

      为了研究高脂条件下内皮细胞释放 TGF-β 的情况，研究者在猪内皮细胞中加入油酸，模拟内皮细胞在 IMF 中的作用。结果证实，猪内皮细胞在高脂环境中会释放更多的TGF-β1。

7. 外源性 TGF-β 抑制小鼠 IMF 沉积

      接着，研究者对体内 TGF-β 对 IMF 的影响展开了研究。在通过向小鼠肌肉注射甘油构建的 IMF 再生模型中，对肥胖小鼠注射 TGF-β 后，抑制了 IMF 的产生以及肌肉修复。与之相反，注射 TGF-β 抑制剂 ITD-1 相较于普通小鼠，促进了肥胖小鼠的肌肉再生。该研究结果证实了TGF-β 可以作为治疗肥胖个体肌肉萎缩的治疗靶点。

研究结论

      这项研究揭示了TGF-β信号通路通过抑制脂肪生成来抑制 IMF 沉积。肥胖猪的IMF中存在内皮细胞来源的TGF-β1，而瘦肉型猪则主要表达FAPs自身产生的TGF-β2。该发现为治疗肥胖相关肌肉萎缩和改善肌肉功能提供了新的治疗靶点，并为理解肌肉萎缩的分子机制提供了重要见解。

原文链接：

https://www.sciengine.com/SCLS/doi/10.1007/s11427-024-2696-5