单细胞测序描述了转移性结膜黑色素瘤的临床决策

       上海交通大学医学院附属第九人民医院眼科范先群院士、许诗琼副主任医师团队于2024年6月在Cell Discovery上发表题了为“Single-cell sequencing depicts tumor architecture and empowers clinical decision in metastatic conjunctival melanoma”的研究论文，作者对原位及转移性结膜黑色素瘤肿瘤（CoM）进行了单细胞测序并联合空间蛋白质组学，揭示了CoM肿瘤发生和进展过程中TME的景观和异质性，为远端转移性CoM的临床决策提供了支持。烈冰生物参与了本研究的单细胞测序和生物信息数据分析工作。

发表期刊: Cell Discovery

影响因子: IF=21.9

发表时间: 2024年6月

一、研究背景及方法

1、研究背景

      结膜黑色素瘤（CoM）是一种潜在致命的恶性肿瘤，起源于眼球、眼睑结膜泪腺。这种疾病因其起源不明、对肿瘤微环境了解不足、转移率高、死亡率高而难以治疗。尽管采用了多种治疗策略，远端转移性CoM的临床结果仍然不佳。因此，揭示组织结构、区分肿瘤起源和分析TME的异质性对于制定治疗策略至关重要。本研究作者通过单细胞测序（scRNA-seq）技术，深入分析CoM在不同肿瘤阶段的细胞景观，特别是肿瘤微环境中的CAFs以及它们与血管生成潜力和VEGFR表达增强之间的关系，以及CD8+ T细胞比例的变化对免疫环境的影响。研究结果不仅为CoM的临床治疗提供了新的策略，也为将单细胞测序数据整合到癌症治疗决策中提供了新概念。

2、实验设计

采样组织：正常结膜样本（n = 3）和结膜黑色素瘤（n=7（3个稳定和4个远端转移））

单细胞捕获平台：BD Rhapsody

主要技术手段：单细胞测序、空间蛋白组、免疫荧光染色临床试验等

烈冰NovelBrain云平台分析工具：细胞聚类分析、差异基因分析、拟时序分析、细胞通讯分析、染色体拷贝数变异（CNV）分析等

二、主要研究结果解析

1、良性结膜和CoM的微环境特征

      研究团队对3个正常结膜和7个结膜黑色素瘤样本进行了scRNA-seq测序，经过质控，共获得47,017个单细胞。其中，14939个细胞来自良性结膜组织，其余32078个细胞来自肿瘤组织。采用无监督聚类分群后，根据marker基因鉴定为黑素细胞/黑色素瘤细胞、T细胞、B细胞、浆细胞单核细胞、中性粒细胞、肥大细胞、内皮细胞、成纤维细胞和上皮细胞。同时统计了良性病变和CoM病变的分布情况，再根据采集这些样本的患者的随访情况，进一步分为稳定肿瘤（ST）组和远端转移肿瘤（DMT）组。

2、拟时序分析表明肿瘤发生及转移过程中致癌信号通路激活

      为了深入理解结膜黑色素瘤（CoM）的起源和转录状态，研究团队对3041个非恶性黑色素细胞和11,964个黑色素瘤细胞进行了拟时序分析。发现了两种细胞发展谱系和三个转录状态独特的细胞簇。通过Monocle 2软件的BEAM模型和分层聚类，研究者揭示了黑色素瘤细胞中关键功能通路的激活，并通过免疫荧光分析在恶性样本中验证了这些通路的活性增强。此外，研究还发现稳定肿瘤(ST)组与远端转移肿瘤(DMT)组的黑色素瘤细胞具有不同的进化轨迹，其中远端转移组的细胞激活了与肿瘤远端转移相关的信号通路，如糖酵解和谷胱甘肽代谢。这些发现不仅为CoM的起始和发展机制提供了新的见解，也指出了CoM与其他黑色素瘤亚型间可能共享的转化模式。

3、CAFs通过增强血管生成来支持肿瘤向远端转移

       研究团队对肿瘤微环境（TME）中的间质成纤维细胞，特别是癌相关成纤维细胞（CAFs）和肌成纤维细胞的作用进行了深入分析。研究发现，在远端转移性结膜黑色素瘤（CoM）的样本中，CAFs的数量较稳定肿瘤组显著增多，暗示了它们在促进肿瘤远端转移中的潜在作用。通过特定标记基因的表达分析，CAFs显示出与血管生成密切相关的基因表达模式，并与血管内皮系统细胞有正相关性，指向了CAFs可能通过增强血管生成来促进肿瘤转移的机制。利用激光捕获显微切割和质谱分析技术，研究者从临床样本中成功分离并鉴定了CAFs和肌成纤维细胞，并通过免疫荧光和Matrigel管状形成实验确认了CAFs在血管生成中的作用。这些结果不仅为CAFs在TME中的功能提供了新的见解，也为针对CoM的治疗策略提供了可能的新靶点。

4、免疫微环境与远端转移性CoM的相关性

      研究团队深入分析了肿瘤免疫微环境对肿瘤细胞适应性、可塑性的影响及其在临床结果中的关键作用。通过对免疫细胞进行重聚类分析，研究者鉴定了T细胞、B细胞、肥大细胞、单核细胞、中性粒细胞和浆细胞等免疫细胞类型，并发现在稳定肿瘤（ST）组和远端转移肿瘤（DMT）组之间存在显著的免疫细胞比例异质性。特别是，DMT组中CD8+ T细胞的浸润水平降低，这与肿瘤样本中的转录组分析结果一致，表明DMT组的CD8+ T细胞表现出不同的基因表达谱，其中上调基因与下调基因涉及免疫相关途径，如抗原加工和呈递、T细胞分化以及自身免疫性疾病。这些发现揭示了远端转移性CoM中免疫微环境的独特特征，特别是CD8+ T细胞的减少和功能状态的改变，这可能导致肿瘤免疫监视的减弱和免疫治疗反应的降低。

5、在远端转移性CoM中功能性CD8+ T细胞减少

      研究者进一步探究CD8+ T细胞的异质性，共分为五个亚型。观察到DMT组中CD8+幼稚T细胞（Tn）的比例显著升高，且这些细胞表现出幼稚和功能失调的表型，如IL7R、LEF1、SELL和CCR7的表达增加。这种幼稚T细胞群的细胞毒性减弱在转移性肿瘤中已被观察到，表明在远端转移性CoM中，T细胞重编程发挥了关键作用。进一步分析显示，DMT组的CD8+效应T细胞（Teff）和CD8+记忆T细胞（Tmem）的浸润水平显著低于ST组，且DMT组的CD8+ Teff细胞中PDCD1（抗PD1治疗的靶点）的表达增加，进一步强调了转移性微环境中T细胞群的功能障碍。免疫荧光（IF）染色结果验证了这些发现，表现出CD8+ T细胞在ST组和DMT组样本中的特征性变化。总体而言，这些结果表明，远端转移性CoM的免疫微环境中功能失调的Tn细胞比例升高和CD8+ Teff/Tmem细胞的低浸润导致了一种相对静止的微环境，将远端转移性CoM描述为一种“冷”肿瘤，其中功能性T细胞被排除。空间蛋白质组学分析显示与单细胞测序的研究结果一致，进一步证实了CAF介导的血管生成和功能失调T细胞在转移性CoMs的 TME中的作用。

6、VEGFR和PD-1联合治疗改善远端转移CoM患者疗效

     研究团队针对远端转移性结膜黑色素瘤（CoM）患者，鉴于转移性CoM和转移性粘膜黑色素瘤对抗PD-1单药治疗的有限反应，启动了一项临床试验，探索VEGFR阻断剂（阿帕替尼）联合抗PD-1疗法（坎雷利珠单抗）的临床效果。治疗过程中，患者CoM-10在接受VEGFR抑制剂和抗PD-1治疗后病情稳定，在14个月后出现进展，但最终随访22.42个月后因脑转移去世；患者CoM-11在接受3个疗程的联合治疗后，未观察到疾病进展。根据RECIST 1.1标准评估，两例患者的肿瘤负荷均有所下降。进一步分析表明，与其他治疗方式相比，接受VEGFR阻断和抗PD-1联合治疗的患者显示出延长的中位生存时间（23.71个月），表明这种联合治疗策略可能为远端转移性CoM患者提供了一种新的治疗选择。

三、研究结论

       研究者的研究深入分析了结膜黑色素瘤（CoM）的肿瘤微环境（TME），揭示了CoM在肿瘤发生和进展过程中的细胞异质性，特别是癌相关成纤维细胞（CAFs）在增强血管生成和促进远端转移中的作用，以及CD8+ T细胞在免疫环境中的排除现象。这些发现不仅增进了研究者对CoM复杂性的理解，而且为临床治疗决策提供了重要支持。基于这些发现，研究者启动的临床试验评估了VEGFR阻断与抗PD1疗法的联合使用，为远端转移性CoM患者提供了一种新的治疗策略，展现出改善患者预后的潜力。

烈冰生物单细胞捕获方案