管腔祖细胞分泌促血管生成素以促进炎性乳腺癌的血管生成和转移

       烈冰生物合作伙伴中山大学第一附属医院乳腺疾病中心林颖主任医师团队于2024年6月在《Cancer research》期刊发表了题为“A Subpopulation of Luminal Progenitors Secretes Pleiotrophin to Promote Angiogenesis and Metastasis in Inflammatory Breast Cancer” 的研究论文。

      该研究利用单细胞测序等技术发现 PTN⁺LP 细胞在炎性乳腺癌（IBC） 肿瘤中富集，LP细胞分泌的PTN 可直接与内皮细胞上 NRP1 受体结合诱导尖端型内皮细胞形成，促血管生成。同时，血管周细胞在 IBC 患者红肿皮肤中积累，与IBC转移有关。体外实验表明，PTN 通过 NRP1 促进内皮细胞运动和血管生成，可能不依赖于 VEGFA 和 VEGF 信号通路。烈冰生物参与了本研究中的部分单细胞转录组测序实验以及数据分析工作。

  发表日期：2024年6月

  发表期刊：Cancer research

  影响因子：IF= 12.5

一、研究背景及方法

1、研究背景

      炎性乳腺癌（IBC）是一种罕见的高度恶性的乳腺癌亚型，5年总生存率仅为40%至60% 。IBC独特的临床特征包括特殊的水肿和红斑样皮肤改变。IBC包含所有乳腺癌分子亚型，组织病理学无特异性诊断，并且导致炎症和促进转移的潜在机制尚未阐明。因此，探究导致IBC发展的发病机制和分子机制，寻找新的靶点指导治疗，刻不容缓。

2、实验设计

实验样本：

17例IBC患者：肿瘤组织（n=16）、红肿皮肤组织（n=15）

5例非IBC患者：肿瘤组织（n=5）、带肿瘤的皮肤组织（n=3）、正常皮肤组织（n=2）

单细胞捕获平台：10 × Genomics

主要技术手段：单细胞转录组测序（scRNA-seq）、多重免疫荧光染色(mIF)、IBC患者血清分析等。

NovelBarin云平台分析：细胞聚类分析，拟时序分析，Pathway分析等。

二、主要研究结果

1. 单细胞转录谱定义了 IBC 的细胞生态系统

       研究团队通过对17例IBC患者的肿瘤组织（n=16）和红肿皮肤组织（n=15），5例非IBC患者的肿瘤组织（n=5）、带肿瘤的皮肤组织（n=3）和正常皮肤组织（n=2）进行单细胞 RNA 测序（scRNA-seq），最终对 142,841 个上皮细胞、66,598 个免疫细胞和 36,436 个基质细胞进行降维聚类分析，共鉴定出16 种主要的细胞类型，包括恶性细胞、PTN⁺LP 细胞、ACTA2⁺肌上皮（Myo）细胞、KRT8⁺成熟腔上皮（ML）细胞、KRT14⁺基底细胞、KRT1⁺分化角质形成细胞（KC）、KRT14⁺基底 KC、B 细胞、浆细胞、T 细胞、髓系细胞、自然杀伤（NK）细胞、成纤维细胞、PVL 细胞、内皮细胞（ECs）和黑色素细胞。

      接下来，通过计算每个亚群中观察到的细胞数与预期细胞数的比率（R_o/e）来量化富集分数。结果表明，非恶性上皮细胞亚群 PTN⁺LP 细胞在 IBC 肿瘤中呈现出最为显著的富集状态。在 IBC 患者肿瘤的上皮细胞中，PTN⁺LP 细胞占比为 2.84% 至 71.26%；而在非 IBC 肿瘤中，其占比仅为 0.04% 至 0.96%。PTN⁺LP 亚群的显著特征是 PTN 基因的高表达，该基因是中枢神经系统胚胎发生的重要发育因子。然而，PTN 在恶性细胞中的表达水平极低。

2. PTN + LP 亚群富集在IBC 肿瘤中

       随后，研究者把scRNA-seq数据与三个已发表的单细胞转录组数据集进行整合，在IBC和非IBC患者肿瘤组织中鉴定了5个主要亚群，分别是KRT14⁺基底细胞、PTN⁺LP细胞、PTN^-LP细胞、KRT8⁺ML细胞以及ACTA2⁺Myo细胞。经过细胞占比统计，发现PTN⁺LP细胞在IBC肿瘤中呈现富集状态，而PTN^- LP细胞则在非IBC肿瘤中富集，这与之前的结果相符。接着，研究者对GEO数据库（GSE22597）中25例IBC患者的RNA微阵列数据展开分析，并利用RNA-seq实验进行验证，结果均表明IBC肿瘤中PTN的表达高于非IBC肿瘤。之后，研究团队借助多重免疫荧光（mIF）染色技术、免疫组化技术（IHC）以及ELISA实验，同样证实了上述结论。

      以上结果暗示PTN有可能作为IBC患者的一种生物标志物。通过通路富集分析可知，在IBC肿瘤中，内皮细胞迁移、参与发芽血管生成的细胞迁移以及血管生成通路均上调。基于此，研究者提出猜想：PTN ⁺LP细胞是否能够调节血管生成，进而有助于构建独特的IBC特异性微环境。

3. PTN⁺LP 细胞通过 PTN^-NRP1轴与 EC 相互作用

PTN⁺LP细胞可能在 IBC 中具有促血管生成的作用，鉴于此，研究团队开始关注内皮细胞。通过对内皮细胞重新聚类，鉴定出六个亚群，包括动脉内皮细胞(GJA5) ，毛细血管内皮细胞(CA4) ，静脉内皮细胞(ACKR1) ，淋巴管内皮细胞(PROX1) ，tip内皮细胞(CXCR4)和未成熟内皮细胞(APLNR) 。

进一步分析发现，与非IBC患者的肿瘤、非IBC患者的皮肤组织以及正常组织相比，具有传统血管生成表型的尖端型内皮细胞在IBC患者的肿瘤和皮肤组织中呈现出富集状态。

      随后，研究团队开展了单样本基因集富集分析（single-sample GSEA）。分析结果显示，在炎性乳腺癌患者的肿瘤和红肿皮肤中，标准化的PTN基因表达与尖端型内皮细胞得分之间存在显著的正相关关系。这一结果表明，PTN在血管生成过程中扮演着至关重要的角色。配体受体(L-R)算法也证实了肿瘤中 PNT⁺LP 细胞和 EC 之间具有强相互作用。

研究人员对肿瘤和皮肤样本进行了多重免疫组化（mIF）染色，结果表明，尖端型内皮细胞（CD31⁺CXCR4⁺）在IBC 患者的肿瘤以及红肿皮肤中呈现出富集现象。

在此基础上，研究团队进一步运用mIF染色技术，对PTN⁺LP细胞和NRP1⁺尖端型内皮细胞的比例进行量化分析。结果显示这两种细胞的比例呈现出显著的正相关关系。通过对大量RNA-seq数据以及公共数据进行相关性分析，发现PTN的表达与VEGFA / VEGF信号通路并无相关性。

以上研究结果表明，在 IBC 患者的肿瘤和红肿皮肤中，LP 细胞分泌的 PTN 可以以不依赖 VEGFA 的方式促进血管生成。

4. PVL 细胞亚型及其功能特征

已有研究显示，PVL细胞与乳腺癌转移存在关联，而且在血管生成的进程中，尖端型内皮细胞能够募集PVL细胞。PVL细胞通过和内皮细胞紧密接触，进而促进血管的稳定性。基于此，研究者随后将PVL细胞划分为四个簇，分别是PVL_MYH11、PVL_ MMP9、PVL_CCL19和PVL_IGFBP3。其中，PVL _MYH11亚群存在肌源性分化基因富集，而PVL_ MMP9、PVL_CCL19和PVL_IGFBP3这三个亚群则富集了与未成熟和干性表型相关的基因。

接着，研究者进行拟时序分析，结果推测了从 PVL_IGFBP3，PVL_MMP9和 PVL_CCL19到 PVL _ MYH11的动态分化状态。

      接下来研究者分析了内皮细胞和 PVL 细胞之间潜在的相互作用网络，发现在IBC患者的红肿皮肤中，这两个亚群之间的相互作用比非IBC患者的皮肤中更频繁。

       接下来，研究者分析了 PVL 细胞在IBCs和非IBCs中的分布。结果发现，与非IBC和正常皮肤相比，IBC皮肤更多的富集PVL_MMP9；与IBC肿瘤相比，IBC红肿皮肤更多的富集PVL_MMP9和PVL_CCL9。mIHC染色验证了PVL细胞在IBC患者受影响皮肤中的显著富集。

      为了研究 PVL_MMP9和 PVL_CCL19的生物学功能，研究者进行了通路富集分析。结果显示，在 PVL_MMP9细胞中，与细胞外间质(ECM)组织、胶原纤维组织和细胞粘附有关的通路上调。在PVL_ CCL19细胞中 Rho 蛋白信号转导和细胞迁移的正调控水平等通路上调。以上结果表明，PVL_MMP9和 PVL_CCL19在 IBC 患者的受影响皮肤中富集，除了参与血管生成外，还促进肿瘤细胞转移。

5. IBC 患者红肿皮肤中的恶性细胞侵袭性更强，更易于转移

      研究者利用协同非负矩阵分解(cNMF)、L-R 分析等方法，发现与 IBC 患者相比， IBC 患者红肿皮肤中的恶性细胞具有更具侵袭性的表型，这可能与 PVL_MMP9/PVL_CCL19亚群的富集有关，从而部分解释了为什么具有独特皮肤表现的 IBC 具有强烈的转移能力。

6. PTN 通过以 VEGFA 非依赖性方式与 NRP1 结合促进内皮细胞运动和发芽

  为了探索PTN 是否可以诱导 EC 的迁移，血管生成，研究者进行了剂量反应实验，结果发现添加重组 PTN 蛋白促进了体外 HUVEC 迁移和管形成。HUVEC 发芽试验结果也显示PTN 处理后，芽的平均长度和数量增加。并且敲低 NRP1显著抑制了重组 PTN 蛋白诱导的 HUVEC 的迁移，管形成和发芽能力。该结果表明 PTN 主要通过 NRP1发挥其功能。

  研究者还通过一系列体外实验证实了 PTN^-NRP1轴参与血管生成的调节。临床数据和TCGA分析的整合也强调了PTN在IBC进展中的关键作用，可能通过促血管生成功能。

三、研究结论

   该研究通过多组学手段全面解析了IBC的分子特征，首次提出了IBC乳腺实质改变的科学假说，即PTN^-NRP1轴是诱导IBC血管生成的关键信号轴。此外，本研究揭示了IBC红肿皮肤中未成熟PVL细胞亚群在肿瘤转移中的重要作用，为IBC的发病机制和进展提供了理论基础，并为其治疗提供了潜在的靶点。

原文链接：

DOI: 10.1158/0008-5472.CAN-23-2640