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北京协和医院张太平教授团队于2024年8月在《Cancer Letters》期刊发表了题为“Single-cell RNA-seq reveals heterogeneity in metastatic renal cell carcinoma and effect of anti-angiogenesis therapy in the pancreas metastatic lesion” 的研究论文。
本研究通过单细胞RNA测序分析了转移性透明细胞肾细胞癌的异质性肿瘤微环境（TME），特别关注了罕见且治疗存在争议的胰腺转移。研究发现胰腺转移的TME具有缺氧和炎症特征，PAX8-myc信号通路激活和代谢重编程现象，同时分析了内皮细胞、成纤维细胞和T细胞等活性成分，并评估了抗血管生成治疗的效果。研究还探讨了胰腺向性、基因组不稳定性及免疫治疗反应的机制，为理解转移TME的异质性及指导肾细胞癌胰腺转移的治疗提供了新证据。烈冰生物参与了本研究中的单细胞转录组测序实验工作。
发表期刊: Cancer Letters
影响因子: IF=9.1
发表时间: 2024年8月
一、研究背景及方法转移性透明细胞肾细胞癌（mRCC）的肿瘤微环境（TME）具有异质性。在这类癌症的转移病灶中，胰腺转移较为罕见，且其治疗方法尚存争议。本研究纳入了广泛的原发性和转移性病变样本，并通过单细胞RNA测序技术来揭示其独特的转移性TME特征。
2、实验设计
实验样本：术后无转移的原发性RCC样本（n=3）；伴有多发性转移的原发性RCC样本（n=3）；原发性RCCbm的骨转移样本（n=3）；原发性RCCpm的胰腺转移样本（n=1）
单细胞捕获平台：BD Rhapsody
主要技术手段：单细胞转录组测序（scRNA-seq）、免疫组织化学（IHC）。
NovelBarin云平台分析：细胞聚类分析，拟时序分析，Pathway分析，细胞通讯分析等。
二、主要研究结果
1、原发性与转移性肾细胞癌TME的组成与功能差异分析
为了探究肾细胞癌（RCC）患者中的肿瘤微环境（TME）异质性，研究者选择了三个队列进行深入分析，包括无转移的原发性RCC样本(个)、多发转移的原发性RCC样本（3个）、骨转移（RCCbm）样本（3个），以及额外补充的一个临床和病理诊断为肾癌转移到胰腺（RCCpm）的样本。其中，对一个RCCpm样本进行了单细胞RNA测序，所有患者未接受辅助治疗。研究整合了所有样本，获得了60,983个细胞和25,280个基因进行下游分析。通过无监督聚类和典型基因标记鉴定，研究者大致识别了8种细胞类型（B细胞、上皮细胞、恶性细胞、成纤维细胞、肥大细胞、髓系细胞、中性粒细胞、T细胞），并发现T细胞和髓系细胞比例高，而上皮细胞和B细胞较少，表明肿瘤内免疫环境活跃。
在分析不同队列的肾细胞癌样本时，研究者发现即使RCCpm样本的细胞数量最多，各队列间也没有明显偏差，显示出显著的异质性。与原发性RCC相比，RCCpm和RCCbm样本中存在独特的未融合细胞簇，且RCCbm样本的细胞数量较少。通过比较转移性和原发性RCC样本之间的不同表达基因（DEGs），研究者发现了一些在转移样本中表达上调的功能基因，如CD8A和S100A8/9。此外，还观察到成纤维细胞等细胞类型中与细胞外基质建模和炎症信号传导相关的基因表达变化，表明转移环境中的细胞发生了获得性或适应性的功能转换。这些发现揭示了原发性和转移性肾细胞癌样本中TME的异质性，以及转移环境中特定细胞类型的适应性变化。
2、RCCpm TME的代谢重编程与生物合成变化
在对RCCpm样本的TME进行分析时，研究者发现与原发性胰腺癌相比，RCCpm TME具有显著的异质性，表现为胰腺星状细胞和内分泌细胞的缺失。在10,890个通过质量控制的细胞中，上皮细胞数量最多，其次是T细胞和巨噬细胞，而成纤维细胞数量较少。免疫组化（IHC）结果显示，与正常胰腺组织相比，RCCpm TME中巨噬细胞浸润增多，成纤维细胞减少且排列紊乱。
研究者进一步研究了RCCpm TME的细胞核型，发现几乎所有非整倍体细胞都是上皮细胞，这些被认为是高度恶性的细胞，而二倍体上皮细胞则被定义为是低恶性潜能或正在癌变的细胞。进一步分析显示，非整倍体上皮细胞与其他上皮细胞之间的DEGs主要涉及能量代谢、蛋白质合成和细胞黏附等与肿瘤进展相关的功能。这些发现表明，与原发性肾细胞癌和RCCbm相比，RCCpm TME表现出独特的特征，包括代谢重编程、细胞黏附改变和活跃的蛋白质合成，提示RCCpm TME活跃且具有侵袭性。
3、PAX8-MYC信号激活促进上皮细胞缺氧和炎症性TME
为了深入理解RCCpm肿瘤细胞的分子机制并寻找治疗靶点，研究者专注于分析RCCpm肿瘤微环境中的上皮细胞和肿瘤细胞。通过无监督聚类方法，研究者从所有上皮细胞中识别出四个不同的亚群。NDUFA4L2作为肾细胞癌的标记基因，在肿瘤细胞中广泛表达，而CFTR（原发性胰腺癌细胞和胰腺上皮细胞的标记基因）在上皮细胞中几乎不表达，这进一步确认了RCCpm与胰腺组织和原发性胰腺癌的不同。拷贝数变异分析（CNVs）显示NDUFA4L2的表达与基因组的核型和稳定性相关，非整倍体细胞中NDUFA4L2的表达量高，表明其高度恶性。通过CA9、CD10、CK7的染色，研究者在组织学水平上确认了RCCpm。
基因富集分析（GSEA）揭示了不同上皮细胞簇在信号通路中的特定变化：上皮细胞簇1中TNFα信号通过NF-κB和P53通路上调，而氧化磷酸化、myc靶点和ROS通路下调，这些通路表明，上皮簇1可能是肿瘤前阶段的转运细胞，但没有进展为恶性细胞。其他簇中myc靶点和氧化磷酸化通路的上调暗示Myc信号通路在胰腺转移中的关键作用。上皮簇3表现出补体、缺氧和EMT通路的上调，而上皮簇2则显示糖酵解和脂肪酸代谢通路的上调，与肿瘤微环境（TME）的缺氧和炎症特征相一致。上皮簇0的eIF4B和RPL21表达表明这是具有活跃蛋白合成和核糖体活性的终末肿瘤细胞，与非整倍体核型相关。RNA速率分析（RNA velocity）显示，上皮簇2倾向于发展成为基因组不稳定的簇0，而二倍体上皮细胞则可能发展为基因组稳定的上皮细胞或基因组不稳定的恶性上皮细胞。
研究团队分析了不同上皮细胞簇中的基因表达差异（DEGs），并观察到从上皮簇1到上皮簇0的进展趋势。通过将上皮簇1设为根节点进行拟时序分析，结果与DEGs分析一致。研究还证实了肾癌中Myc信号通路通过PAX8与CCND1、HNF1B和HIF2A相互作用和调控，这些基因在恶性细胞簇中表达上调。免疫组化（IHC）结果显示，与正常胰腺组织相比，RCCpm样本中PAX8表达上调，且有些RCC细胞同时表达PAX8和MYC，这进一步证实了PAX8-MYC通路在RCCpm中的关键作用。研究最终确定了四种不同的上皮细胞簇，其中Myc信号通路和氧化磷酸化途径在恶性细胞中显著，而代谢重编程表现为缺氧和炎症环境下糖酵解和脂肪酸代谢的激活。
4、RCCpm TME的主动免疫反应及内皮细胞核心作用
在研究RCCpm肿瘤微环境（TME）的细胞异质性时，研究者们发现了6种免疫细胞类型，并观察到髓系细胞如巨噬细胞能表达高细胞因子，激活先天免疫并诱导T细胞激活。同时大多数T细胞为幼稚T细胞，而CD8+ T细胞显示出活跃的细胞毒性功能；B细胞的缺失可能与个体差异或测序偏差有关。研究还发现，Epi_0_Ribo、成纤维细胞、巨噬细胞和内皮细胞在TME中特别活跃，其中内皮细胞是TME中最活跃的成分，而CD8+T接受信号最活跃，成纤维细胞输出信号最活跃。内皮细胞与多种信号通路相关，包括VEGF、PECAM1、SELL、CDH5和GDF等，这些信号与肿瘤进展和免疫调节有关。进一步分析了内皮细胞的靶簇，发现巨噬细胞、CD8+ T细胞、上皮细胞和肿瘤细胞均有一些显著活跃的信号，表明内皮细胞在RCCpm TME中的关键作用，特别是与免疫细胞的相互作用。这些发现强调了RCCpm TME中积极的免疫反应和内皮细胞的关键作用。
5、舒尼替尼验证为RCCpm有效治疗手段
根据以往研究，RCCpm被视为血管生成亚型，TKIs是其一线治疗选项，效果可能不亚于“减瘤性肾切除术”。同样，内皮细胞被确定为RCCpm TME中的关键作用，因此研究者接下来分析了RCCpm样本的潜在药物敏感性。研究通过机器学习模型分析了RCCpm样本的药物敏感性，发现尽管初步分析显示对多数一线治疗药物耐药，但进一步分析表明大多数酪氨酸激酶抑制剂对RCCpm有效，包括被推荐为一线靶向治疗的舒尼替尼。这些发现证实了内皮细胞在RCCpm TME中的关键作用，并支持了异质性转移性RCC TME导致不同生物学特征和治疗反应的假设。
三、研究结论
文章揭示了转移性肾细胞癌尤其是胰腺转移的肿瘤微环境具有显著异质性，其中PAX8-MYC信号通路发挥关键作用，内皮细胞与免疫细胞的相互作用在肿瘤微环境中尤为重要。研究还发现，尽管RCCpm对某些酪氨酸激酶抑制剂如舒尼替尼表现出敏感性，可能作为有效的治疗选项，但免疫检查点抑制剂的反应较为复杂，需要进一步研究以深入理解其机制。
