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肿瘤-神经交界处的钾离子通道增强癫痫胶质母细胞瘤的神经元兴奋性
烈冰生物合作伙伴复旦大学附属华山医院迟喻丹研究员团队于近期在《Neuron》期刊发表了题为：“Potassium ion channel modulation at cancer-neural interface enhances neuronal excitability in epileptogenic glioblastoma multiforme”的研究论文。
该研究揭示了胶质母细胞瘤（GBM）相关癫痫的潜在机制，发现癫痫GBM患者的癌细胞倾向于向祖细胞样状态转变。表达KCND2的少突胶质细胞祖细胞（OPC）样亚群主要富集在肿瘤-神经交界处，KCND2编码的电压门控钾通道Kv4.2可介导肿瘤细胞 A 型钾电流，进而增强神经元兴奋性，最终引发癫痫。烈冰生物参与了本研究中的单细胞核转录组测序实验以及数据分析工作。
发表期刊: Neuron
影响因子: IF=14.7
发表时间: 2024年11月
一、研究背景及方法
1、研究背景
GBM是常见恶性脑肿瘤，侵袭性强、致死率高。其肿瘤细胞浸润生长，与神经回路整合形成病理反馈通路，致神经系统损伤，引发癫痫等疾病。然而，驱动肿瘤侵袭及癫痫发作机制不明，因缺患者来源及临床前模型，且 GBM 具遗传、表观遗传和环境异质性，癫痫相关肿瘤亚群及神经元兴奋性变化仍不清楚。
2、实验设计
实验样本：7名非癫痫患者和10名癫痫患者的额叶、颞叶和顶叶脑区肿瘤样本
单细胞捕获平台：10X Genomics
NovelBarin云平台分析：细胞聚类分析，拟时序分析，GO分析，Pathway分析等
二、主要研究结果
1、肿瘤细胞的固有能力促进GBM相关性癫痫的发展
为探寻癌症相关神经学疾病的共性，研究者对 806 名GBM患者展开系统临床筛查，着重研究易癫痫发作脑区的异常神经活动。其中，包括106名癫痫患者（Epi）和700名非癫痫患者（Non-epi）。结果发现所有患者的肿瘤在脑区域，尤其是前脑区域和颞脑区域的发生率非常高，Epi 组肿瘤多累及皮质，Non-epi 组则主要位于皮质下区域。这些发现表明，皮质灰质中的神经元和肿瘤细胞之间可能存在潜在的相互作用，影响癫痫发病。
为明确肿瘤细胞致癫痫能力，研究者将患者前脑区域的肿瘤组织进行原代胶质瘤球培养，然后将原代肿瘤细胞正交移植到小鼠皮质下纹状体，进一步追踪皮质侵袭情况。结果显示Epi组移植体侵袭显著，而Non-epi组侵袭有限。移植 45 天后，在皮质记录 12 小时局部场电位（LFP）并分析功率谱密度（PSD），结果发现GBM 细胞固有特性可引发大脑发作间期节律性活动。
2、肿瘤异质性在伴有癫痫的GBM患者中向祖细胞样群转移
为了探索胶质瘤相关癫痫的分子和细胞决定因素，研究者对7名非癫痫患者和10名癫痫患者的额叶、颞叶和顶叶脑区肿瘤样本进行了单细胞核RNA测序（snRNA-seq）。最终获得78,230个高质量细胞，利用inferCNV算法推断拷贝数变异（CNVs）区分恶性细胞。免疫细胞富集分析和免疫荧光染色结果表明，Epi组中免疫细胞的比例比Non-epi组显著降低。对髓系和淋巴系细胞功能的GO分析显示，Epi组中免疫相关功能，包括免疫反应、抗原呈递和细胞因子分泌均下调。而与免疫细胞和神经元细胞之间通讯相关的通路，包括调节神经元凋亡和对神经生长因子的反应通路则上调。
进一步分析发现来自Epi组的肿瘤细胞中，祖细胞样的家族比例较高，包括高表达SOX4、SOX11、DCX和STMN2的神经祖细胞样（NPC样）亚群，以及高表达PDGFRA、ALCAM、OLIG1和PLP1的OPC样亚群。而Non-epi组的肿瘤细胞在间充质样（MES样）中比例上升，MES相关基因表达水平较高，如VIM、CHI3L1、ANXA2、MT2A、TRIB3，以及具有星形胶质细胞标记物AQP4、GFAP、GLAST、MLC1和CLU的星形细胞样（AC样）亚群。
研究者进一步检测了Non-epi组和Epi组祖细胞样细胞的功能变化。GO分析显示，Epi组肿瘤细胞在神经系统发育、离子跨膜转运和神经元分化功能方面有显著富集。拟时序分析表明Non-epi组和Epi组具有不同的分化轨迹，突显了胶质瘤中肿瘤内异质性向祖细胞样群体转变与临床癫痫发作的相关性。
3、OPC样肿瘤细胞影响周围肿瘤神经元的兴奋性
已有研究表明胶质瘤中OPC样细胞群在整合癌症-神经回路活动和皮质兴奋性方面发挥重要作用，并且OPC样细胞高表达PDGFRA。该研究结果表明，与Non-epi组相比，Epi组肿瘤细胞具有更高的PDGFRA基因扩增，并且在Epi组患者的肿瘤组织中，PDGFRA高表达的OPC样细胞的比例增加，与前述单核RNA测序（snRNA-seq）数据结果一致。
为了探究OPC样肿瘤细胞是否可以改变神经元活性并参与癫痫的发生，研究团队从患有癫痫的GBM瘤中选取了原代OPC样的肿瘤细胞（PDGFRA+细胞）和非OPC样的肿瘤细胞（PDGFRA-细胞），并将它们分别注射到小鼠的前额叶皮质（PFC）中建立皮质GBM移植模型。在移植后第45天对荷瘤小鼠的前额皮质(PFC)进行了皮质网络活动的记录，结果表明OPC样的肿瘤细胞提高了周围皮质PCs的兴奋性。
4、KCND2+ OPC样肿瘤细胞位于肿瘤-神经交界处
为了深入了解与胶质瘤相关癫痫功能上不同的肿瘤亚群，研究者对snRNA-seq数据集中的所有肿瘤细胞进行进一步分析。通过无监督聚类确定了17个细胞亚群簇。考虑到OPC样肿瘤细胞在促进神经元过度兴奋并导致癫痫发生中发挥重要作用，因此重点关注与祖细胞具有类似显著特征的细胞群C11。结果观察到C11主要来源于Epi组（Non-epi组：1.37% ；Epi组：98.63%），并具有显著的OPC特征。GO分析显示C11存在离子传输通路的显著富集，表明离子稳态对胶质瘤相关癫痫有潜在的重要性。在C11中差异表达排名前十位的基因中发现TNR、PCDH15、KCND2、DSCAM和FGF14显著上调。KCND2，也称为K+电压门控通道家族D成员2，有助于确保细胞电活动的正常功能，分析结果发现KCND2主要在祖细胞样的细胞尤其是OPC样细胞中表达，并发现相比Non-epi组患者，Epi组患者PDGFRA 和 KCND2在肿瘤与周围神经组织交界处共表达的频率更高。RNA原位杂交也发现KCND2在癫痫肿瘤组织周边区域的表达显著更高。以上结果表明表达KCND2的OPC样肿瘤细胞位于肿瘤-神经交界处，这可能是GBM患者发生癫痫的潜在基础。
5、肿瘤细胞中存在功能性电压门控钾通道Kv4.2
由KCND2基因编码的Kv4.2是一种电压门控K+通道，可以介导A型K+电流，其特点为快速激活和失活，这对于动作电位（AP）的复极化阶段至关重要。已有研究发现Kv4.2通道分布、表达和功能的改变与癫痫有关。然而，在GBM中KCND2表达与神经元兴奋性之间的关系仍然不清楚。
研究者评估了GBM患者新鲜肿瘤组织切片的K+电流，发现在Epi组患者肿瘤切片中的肿瘤细胞中可以检测到电压门控K+电流，并且激活和失活迅速，符合Kv4.2介导A型K+电流的特征性属性。以上结果表明功能性KCND2（Kv4.2）电压门控K+通道存在于癫痫GBM患者的肿瘤细胞中。
接下来研究者构建了稳定的KCND2敲低的OPC样细胞（OPC-shKCND2）并开发了正位异种移植模型，在接种后第45天监测皮质局部场电位（LFP）活动，结果表明OPC样肿瘤细胞中的KCND2增加了肿瘤周围区域的神经元兴奋性，并伴随癫痫发作。
6、神经电活动分析确定了KCND2在GBM诱导癫痫发生中的共同特征
研究人员在从 GBM 患者获取的 MES-样癌细胞中过表达 KCND2，通过全细胞电生理记录发现过表达细胞存在 A 型 K⁺电流，而对照细胞没有。通过bulk RNA - seq 及相关分析发现，KCND2 过表达与电压门控 K⁺通道和跨膜离子转运相关，且与 CNS 肿瘤和癫痫综合征相关。
随后，研究人员在体内建立了 KCND2 过表达的 GBM 异种移植物。研究发现KCND2 过表达癌细胞的异种移植物癫痫样放电和发作更严重，癫痫发作频率和严重程度均增加。通过对K⁺敏感电极监测发现KCND2 可破坏神经元离子稳态，导致神经元过度兴奋。
最后研究者探讨了 KCND2 在胶质瘤相关癫痫中的作用。通过检测 KCND2 过表达异种移植小鼠脑中兴奋性突触的改变，发现 KCND2 过表达癌细胞周围区域的兴奋性突触显著增加，表明 KCND2 介导肿瘤边缘的突触重塑。接着进一步验证 KCND2 对人类皮层神经元兴奋性的作用，建立了来自人类诱导多能干细胞的皮质类器官，并将表达 KCND2 的癌细胞与之共培养。研究结果表明KCND2 会引起神经元过度兴奋，最终引发癫痫。
三、研究结论
