《Nature Genetics》:成人前列腺空间分辨转录组分析

2025年4月1日，海军军医大学附属长征医院任善成教授，华中科技大学附属同济医院谌科教授和广州医科大学附属第一医院古迪教授等合作在《Nature Genetics》在线发表题为“Spatially resolved transcriptomic analysis of the adult human prostate”的研究论文。

作者通过单细胞测序、空间转录组学等多组学整合分析，旨在构建一个成人前列腺的空间转录组图谱，揭示前列腺的细胞组成、空间异质性以及潜在的前列腺癌细胞起源，为前列腺生物学和疾病（如前列腺癌）提供新的参考。烈冰生物参与了本研究单细胞测序、单细胞ARC测序以及空间转录组测序实验部分。

发表日期：2025年4月

发表期刊： Nature Genetics

影响因子：IF= 31.8

1.研究背景

前列腺是一个具有明显空间异质性特征的器官。为了更好地了解其复杂的结构和细胞组成，本文构建了一个全面的成人前列腺单细胞图谱。前列腺上皮主要由腔内细胞、基底细胞和神经内分泌细胞构成。尽管单细胞RNA测序技术已被广泛用于研究小鼠前列腺和人类恶性前列腺组织，但正常人类前列腺的特征仍不明确，且以往研究常忽略其区域特异性和间充质异质性，凸显了构建更全面细胞图谱的必要性。众多研究探索了前列腺癌的细胞起源，但其特定细胞类型仍不清楚，存在多种理论，近期研究提示罕见前列腺干细胞可能是疾病源头。本研究利用基于液滴的scRNA-seq、单核多组学和空间转录组学方法，鉴定了126个不同的细胞亚群，其中大部分为新发现，通过综合多组学分析，揭示了前列腺癌的潜在细胞来源，显著拓展了对人类前列腺细胞组成的认识。

2.实验设计

实验分组：

Cohort 1：7名患者的前列腺组织

单细胞转录组测序  中央区:移行区:外周区=10：11：12

Cohort2： 4名患者的前列腺组织

（1）单细胞ARC测序  中央区:移行区:外周区=4：4：4 ；

（2）空间转录组测序  中央区:移行区:外周区=1：1：1。

单细胞捕获平台：

BD Rhapsody、10x genomics

主要技术手段：

单细胞转录组（scRNA-seq）测序、单细胞ARC测序（snRNA-seq + snATAC-seq）、空间转录组学（Visium）、免疫组化（IHC）和多重免疫荧光（IF）等

分析方法：

细胞聚类分析、空间特征表达分析、轨迹分析和功能富集分析、细胞间相互作用分析、拷贝数变异（CNV）分析等

主要研究结果解析

1.成人前列腺细胞类型图

研究团队分两个队列中进行了单细胞测序（scRNA-seq），第一个队列使用BD Rhapsody平台对7名患者的33个样本（10例来自中央区，11例来自移行区，12来自外周区）进行测序；在第二个队列对4个不同患者的4个中央区、移行区和外周区样本进行了10X Multiome和Visium空间转录组联合分析（图1a）。

经过严格质控后，获得了253,381个高质量单细胞和34,876个细胞核的转录组谱，用于下游分析。初步注释确定了由标记基因定义的15种主要细胞类型（图1b）。与多组数据相比，单细胞策略捕获了更多的免疫细胞，但更少的上皮细胞，这表明不同细胞类型对基于酶的解离敏感性不同（图1c）。进一步细分细胞谱系确定了126种不同的细胞类型。

2.前列腺上皮细胞亚群分布

进一步对测序所得的两个数据集进行细胞聚类分析，分别得到35个和19个亚群（图2.1a）。这些细胞被分为以下三个主要群体：传统的KRT5+（CK5+）基底细胞和DPP4+（CD26+）管腔/腺泡细胞，以及一个独特的KRT5−DPP4−上皮细胞群，作者将其命名为“前列腺管腔（dLum）细胞。研究显示两个队列中相同的细胞亚群表现出很高的相似性，表明细胞类型注释具有很高的准确性，而在不同分区的细胞分布则具有显著异质性（图2.1b）。

3.dLum细胞亚群和空间定位

进一步通过单细胞转录组分析将dLum细胞分为七个亚群。其中，d1_dLum–Club细胞表达SCGB1A1和SCGB3A1，类似于俱乐部细胞；d2_dLum–KRT4细胞表达KRT4（CK4）和KRT13（CK13），与多能腔内细胞和希洛克细胞相关。基底细胞中约四分之一也表达KRT13，表明希洛克细胞是一个异质性群体。

空间转录组分析显示，d1_dLum-Club细胞靠近尿道导管，与d2_dLum-KRT4细胞相邻（图2.2c），而KRT4−KRT13+基底细胞（B1_Basal-ESR1和B3_Basal-GPRC5A）则分散分布，且两种类型的基底细胞分布互斥，揭示了前列腺导管周围的多层结构。

多色免疫荧光和免疫组化染色进一步验证了这些发现，显示杯状细胞和CK4+细胞位于尿道周围管腔的内侧，而CK4−和CK13+基底细胞位于基底侧。周边腺泡中也检测到少量CK4+和CK4−CK13+基底细胞，CK4+细胞分散在管腔和基底细胞之间（图2.2d)。

此外，d3_dLum-LTF细胞位于多层上皮的末端，形成柱状上皮管并与L1_Lum-LTF连接（图2.2c）。d6_dLum-CNMD是一种罕见的腺管分布细胞，而d7_dLum-SPIB细胞具有潜在的抗原呈递能力，显示出高水平的MHC分子。这些研究揭示了dLum细胞亚群的异质性和功能多样性。

4.基底细胞的亚群和空间定位

研究人员通过分析揭示了两种KRT5+基底细胞谱系（KRT16+KRT17+和KRT16−KRT17−），并由snATAC分析支持（图3a，b）。Krt4+管腔细胞被认为是潜在的干细胞，能够再生前列腺管腔和基底细胞。基于俱乐部细胞、CK4+细胞和CK4−CK13+基底细胞的转录组属性和空间分布，研究提出了一个潜在的分化途径，得到了多轨迹分析支持（图3b、c）。转录因子分析显示两种分化轨迹上的差异激活，解释了KRT17+分支中细胞应激反应因子水平较高的原因（图3d）。

B5_Basal-VCAN细胞是唯一主要位于外周区和移行区的基底细胞亚群（图2b）。空间转录组学显示这些细胞位于腺泡基部，但在TGM4+腺泡中央区域（图3e）和尿道周围导管中缺失。这些细胞表达WNT调控因子（如WIF1和SFRP1）（图3f），可能在前列腺细胞形态的发育和维持中发挥作用（图3g）。

此外，KRT16+ KRT17+分支的一个小分支通过FOXI1+状态和质子泵蛋白的表达（图3b），类似于肾插入细胞和支气管离子细胞，提示其在前列腺液中离子重吸收的潜在功能。轨迹分析显示，分化过程中基础信号通路逐渐丢失，而离子泵表达增加（图3h），表明基底细胞可能是前列腺中离子细胞的来源。免疫荧光染色进一步证实这些细胞主要位于尿道周围的腺体结构中（图3i），且在测序过程中主要捕获于中央区样本（图2b）。

5.区域特异性腺泡结构的鉴定

腔内细胞亚群分析鉴定出八个亚群，其中L6_Lum型4-TGM4细胞特异性存在于中央区，其他亚群主要分布于边缘区和移行区（图2b&图4a)。L1亚群作为dLum3-LTF细胞与腺泡细胞的过渡状态（图2c）。L2/L3亚群以核糖体增多、线粒体减少及HOXB13/NKX3-1/FOXA1等转录因子高表达为特征。L7/L8/L5亚群界限清晰但缺乏特异性标志物，L4细胞表现出个体特异性且未被空间转录组表征。

四种主要腔内细胞亚型（L5-L8）对应四种前列腺腺泡亚型（图4a-h），其基因表达模式通过标记基因分析揭示为四个基因模块（图4c）。空间转录组学显示四种腺泡具有独特的形态学特征（图4d-h），其中中央区腺泡特异性表达TGM4。RNA-seq数据表明L7和L8信号呈中度正相关（图4c），空间转录组学识别出混合1型和2型信号的腺泡（图4d-f），提示细胞状态可能存在可塑性。SFTPA2+腺泡附近检测到1型信号，但外周区和移行区未发现区域特异性腺泡结构。

6.形态良性腺泡中的CNA

研究表明，非恶性前列腺上皮中存在体细胞拷贝数变异（SCNAs），与前列腺上皮内瘤变（PIN）和前列腺癌相关。研究发现，移行区的PIN样本表现出高水平的2型特征，且snRNA-seq数据中也检测到具有类似基因组特征的细胞亚群（图5a–d）。外周区样本中反复检测到含有SCNAs的2型相似增殖性PIN。空间转录组分析显示，不同前列腺区域的病变具有不同的基因特征（图5e–h），如SFTPA2+病变和TGM4+中央区特异性腺泡携带的CNAs（图5i–k），可能由ETV4融合或启动子去甲基化驱动（图5l，m）。随后对TCGA-PRAD数据分析表明，ETV4和ETV1驱动的前列腺癌中TGM4+签名表达增强（图5n）。

值得注意的是，1型Lum细胞始终正常，不含CNAs，而与含有CNAs的2型或SFTPA2+病变相邻。假设1型腺体可能在发生SCNAs或其他肿瘤驱动事件时转化为2型或SFTPA2+腺体。通过比较公共数据集中的正常前列腺数据，发现老年患者的前列腺中SFTPA2+和2型腺体数量较多，而年轻个体样本中几乎检测不到这些特征。这表明在衰老的前列腺中，2型和SFTPA2+腺体可能逐渐积累，尽管需要进一步的数据来确认这一发现。

7.非ETS前列腺癌的分子特征

通过空间转录组学分析，研究验证了含有独特腔内特征的CNA的前列腺腺体的存在，并探讨了其与前列腺肿瘤发生的关系。分析TCGA-PRAD RNA测序数据发现，2型和SFTPA2+特征是ETS−前列腺癌的共同特征，与突变驱动类型无关（图6.1a）。其他上皮特征（如基底细胞和1型腔内细胞）与肿瘤纯度呈负相关（图6.1b)，表明其非恶性身份。类似现象在亚洲队列CPGEA中也观察到，提示ETS−肿瘤可能起源于特定的细胞类型。单细胞RNA测序数据进一步支持这些发现，11例癌症细胞中10例表现出2型特征，其中4例同时表现出SFTPA2+特征（图6.1c-e）。唯一表现出1型Lum细胞特征的病例由ETV4驱动，这与整体RNA测序结果一致。

空间转录组切片显示，2型癌前病变向癌症转变的直接证据。克隆1（正常）和克隆2（肿瘤）均表达2型特征（图6.2f-j），而克隆3具有不同的CNAs，提示其可能是早期分支或独立病变。这些发现支持2型前列腺癌起源于2型腺泡的假设。

此外，研究还发现多个独立的2型肿瘤和SFTPA2+肿瘤，具有不同的CNA模式和克隆起源。每个病变周围均存在正常的1型管腔细胞。这些结果表明，衰老前列腺中CNAs常见，可能发展为多个独立的原发肿瘤，支持前列腺癌的多灶起源模型。

同时研究发现ERG+前列腺癌可能也起源于Type 2和SFTPA2+腔细胞，但这些细胞在ERG+癌中失去了Type 2和SFTPA2+特征。

8.列腺间质中细胞类型研究

前列腺中的间充质细胞主要包括成纤维细胞、平滑肌细胞（SMCs）和周细胞，其中成纤维细胞分为三大类，具高度异质性，可分为12个亚类（图7a、b）。1型成纤维细胞主要分布于中央区和移行区，高表达MHC，具有抗原呈递能力（图7f）；2型成纤维细胞富集于外周区（图7d，e）。不同的WNT相关通路在1型和2型成纤维细胞中选择性富集（图7f)，影响前列腺上皮细胞分化和成熟。因此进一步研究了促进腔内细胞生长并涉及WNT通路的生长因子，以及观察到的谱系特异性表达（图7g)。成纤维细胞分泌不同的生长因子，如RSPO1–RSPO3和NRG1–NRG2，影响腔内细胞的区域表型。第3型成纤维细胞较少见，但表现出第1型和第2型成纤维细胞的特征（图7b、f），同时具有干细胞相关转录因子高活性，可能作为成熟成纤维细胞的前体。空间转录组学显示成纤维细胞分布独特，1型聚集在近端尿道周围，2型散布在外周区腺体结构周围。

此外，研究还在前列腺前纤维肌肉间质区发现少量单纹纤维骨骼肌细胞，单细胞RNA测序和小RNA测序均鉴定出少量卫星细胞（骨骼肌干细胞），施万细胞分散在上皮细胞间并包裹神经末梢。

9.尿道附近的特殊结构

在前列腺中，不同区域的免疫细胞谱型无显著差异。髓系细胞亚群分析显示两个独特巨噬细胞亚群：LYVE1+巨噬细胞（间质巨噬细胞，IM）和SPP1+巨噬细胞（组织驻留巨噬细胞，RTMs）。RTMs与1型成纤维细胞和中性粒细胞相关，而IM与2型成纤维细胞和SMC相关。空间转录组分析显示尿道周围缺乏上皮细胞的区域中1型成纤维细胞簇，包封RTMs和少数中性粒细胞，周围是平滑肌组织和2型成纤维细胞。聚集的1型成纤维细胞高表达CHGB，表明存在具有部分神经内分泌功能的特殊结构。

全文总结

本研究通过单细胞测序、空间转录组学和多组学整合分析，构建了一个高分辨率的成人前列腺细胞图谱，揭示了前列腺的细胞组成、空间异质性和潜在的前列腺癌细胞起源。主要发现包括：

1.识别了126种独特的细胞亚型，包括多种新的导管腔细胞和基底细胞亚型。

2.发现Type 2和SFTPA2+腔细胞可能是ETS融合阴性前列腺癌的共同起源细胞。

3.揭示了成纤维细胞的区域特异性和功能，特别是它们在前列腺上皮细胞分化中的作用。

4.提供了CNV与前列腺癌发生发展的直接证据，支持前列腺癌的多灶性起源模型。