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2025年1月8日，中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心（神经科学研究所）周海波研究员和张连升博士在 Nature 子刊 Nature Aging 上报道了题为：“Modulating mTOR-dependent astrocyte substate transitions to alleviate neurodegeneration” 的研究论文。
作者利用多时间点的转录组测序、单细胞测序等技术揭示了星形胶质细胞在神经炎症条件下变为神经毒性之前表现出神经保护功能的机制，并强调了mTOR在星形胶质细胞中的调节作为神经退行性疾病的潜在治疗策略。烈冰生物参与了本研究单细胞测序实验工作。
发表日期：2025年1月
发表期刊：Nature Aging
影响因子：IF= 17
一、研究背景及方法1、研究背景
大脑是一个高度异质性的系统，识别不同亚型的脑细胞对于理解其功能至关重要。许多脑细胞，尤其是神经胶质细胞，其亚型或亚态受环境变化的强烈影响。早期研究将星形胶质细胞分为神经毒性和神经保护性星形胶质细胞，分别由神经炎症和脑缺血引起，这些亚型对神经系统疾病的发病机制和治疗具有重要意义。单细胞RNA测序进一步揭示了更多星形胶质细胞亚型，如疾病相关、自噬失调和脂质积累的反应性星形胶质细胞。类似地，小胶质细胞和少突胶质细胞也表现出高度异质性。然而，这些亚型大多基于特定时间点的转录组、蛋白质组或形态确定，不能证明它们是同一细胞群的终态。在本研究中，研究者关注星形胶质细胞对IL-1α、TNF和C1q的反应，发现神经保护和神经毒性亚状态并非独立亚型，而是神经保护亚状态作为不稳定的中间状态，暂时诱导于神经毒性亚状态的转变，揭示了星形胶质细胞在炎症条件下从神经保护性向神经毒性状态的连续转变。
2、实验设计
实验分组：
分离培养的小鼠MD-星形胶质细胞：
ITC（IL-1α + TNF + C1q）药物处理0h：ITC药物处理6h：ITC药物处理24h=1：1：1
单细胞捕获平台：
BD Rhapsody +烈冰Panocell微孔板
主要技术手段：
单细胞转录组（scRNA-seq）测序、RNA测序、免疫荧光染色、蛋白组分析。
NovelBarin云平台分析：
细胞聚类分析，KEGG分析， GO分析 ，拟时序分析等。
二、主要研究结果解析
1、转录组学揭示了反应性星形胶质细胞的转变
为了研究神经毒性反应性星形胶质细胞是否直接来自于神经炎症刺激下的非反应性星形胶质细胞，研究者将小鼠md-星形胶质细胞分别暴露于IL-1α + TNF + C1q（ITC），然后进行RNA-seq。分析结果显示，经ITC处理的星形胶质细胞并没有直接从非反应状态过渡到神经毒性反应状态。相反，他们最初在6小时前上调反应性星形胶质细胞的神经保护亚状态标记物，然后在10小时后上调与神经毒性亚状态相关的标记物，同时下调神经保护亚状态标记物。这些发现表明，反应性星形胶质细胞的神经毒性亚状态的诱导过程可能涉及神经保护亚状态的短暂存在。
研究者对经ITC处理了0、6和24小时的星形胶质细胞进行了scRNA-seq，然后进行了拟时序分析。首先，研究者根据其典型标记物的表达对所有细胞类型进行了分类，并确定了所有星形胶质细胞簇（簇0-3）。接下来，研究者鉴定了4个主要的星形胶质细胞群，分别代表非反应性（簇0）、神经保护（簇1）、神经毒性（簇2）和中间（反应性亚状态，显示两个亚态之间转录组特征；簇3）基于亚状态标记的表达。将中间亚态星形胶质细胞进一步分为4个亚簇（簇3.1-3.4），因为它们在UMAP中彼此分离，可能代表不同的中间阶段。UMAP显示，中间状态的星形胶质细胞群连接了非反应性、神经保护性和神经毒性的亚态簇。拟时序分析表明，ITC处理的星形胶质细胞从非反应状态（簇0）通过中间状态（簇3.1和3.2)过渡到神经保护亚状态（簇1)，然后从神经保护亚状态过渡到神经毒性亚状态（簇2)，也通过中间状态（簇3.3和3.4）。这些数据支持了在单细胞水平上的神经炎症刺激后，星形胶质细胞的神经保护性向神经毒性的转变。
2、星形胶质细胞在蛋白质组学水平上的亚态转变
接着，研究者采用流式细胞术对神经保护和神经毒性表面标记物进行双染色，以评估星形胶质细胞在蛋白水平上从神经保护亚状态到神经毒性亚状态的转变。同时用免疫印迹法分析了ITC刺激后的神经毒性（C3、GBP2和PSMB8）和神经保护性（PTGS2、SPHK1和PTX3）标记物随时间的表达。分析结果显示与转录组的结果相一致。可以看出，蛋白质组学分析也证实了在反应性星形胶质细胞激活过程中存在从神经保护到神经毒性状态的过渡过程。
虽然转录组学和蛋白质组学的发现表明，在反应性星形胶质细胞激活过程中，从神经保护到神经毒性亚状态的转变，但尚不清楚神经保护反应性星形胶质细胞是否真的有对神经元的保护作用。因此，研究者分析了反应性星形胶质细胞分泌的代表性神经毒性和神经保护因子的表达。结果表明，神经保护反应性星形胶质细胞确实可以保护神经元免受有害刺激的影响，证实了反应性星形胶质细胞在外部刺激下进入神经毒性亚状态之前表现出神经保护功能。
3、体内反应性星形胶质细胞的亚态转变
接下来，研究者分析了腹腔注射LPS的小鼠皮质星形胶质细胞的转录组数据。结果显示，注射后3小时神经保护标记物增加，24小时神经毒性标记物显著上升而神经保护标记物恢复至对照水平。通过在不同时间点注射LPS，观察到神经毒性标记物逐渐增加，神经保护标记物先增后减。
免疫荧光染色进一步证实了这些变化，显示神经毒性标记物C3和GBP2在海马LPS模型中持续增加24小时，而神经保护标记物PTGS2和S100A10在8小时LPS注射后先增后减。此外，从LPS处理的小鼠大脑中分离的神经保护星形胶质细胞在体外培养后表现出神经毒性标记物的显著增加，而神经保护标记物降低，表明这些细胞在体内经历了从神经保护到神经毒性的亚状态转变。这些发现表明，从神经保护亚状态到神经毒性亚状态的转变也发生在反应性星形胶质细胞的体内激活过程中。
4、亚状态失衡与AD进展和正常衰老有关
通过分析5XFAD小鼠大脑星形胶质细胞的单核RNA-seq（snRNA-seq）数据，研究者发现，5XFAD小鼠的反应性星形胶质细胞亚状态比例的失衡与疾病进展相关。进一步通过检测体外培养的人星形胶质细胞的亚状态转变过程发现，在ITC刺激后，人类星形胶质细胞也发生了从神经保护亚状态到神经毒性亚状态的转变。此外，通过比较无病理对照组与早期病理AD组、早期病理AD组与晚期病理AD组，研究者发现随着AD症状的恶化，神经保护亚型和神经毒性亚型的比例明显失衡，提示在AD患者的疾病进展中也存在反应性星形胶质细胞亚状态比例的失衡。
据之前的研究报道，正常的衰老也会诱导星形胶质细胞的神经毒性反应性。因此，研究者分析了来自5个26岁阶段（婴儿、儿童、青少年、成人和衰老）的人类海马的snRNA-seq数据，并将星形胶质细胞簇分为四个亚簇发现神经毒性反应性星形胶质细胞的比例随着年龄的增长而持续增加，而神经保护反应性星形胶质细胞的比例最初在儿童阶段增加，但随后在达到青春期后下降。值得注意的是，海马的神经毒性反应性星形胶质细胞的比例与前额叶皮质的神经毒性反应性星形胶质细胞的比例，可能是因为这两组结果从不同的大脑区域进行分析。更重要的是，随着年龄的增加，神经保护亚物质和神经毒性亚物质的比例失衡变得更加明显，表明正常衰老也与星形胶质细胞亚物质失衡有关。
综上所述，这两种反应性星形胶质细胞亚态比例的失衡可能导致了AD的认知能力下降和正常衰老。
5、mTOR调节神经保护亚物质的诱导
接下来研究者采用RNA-seq方法比较了ITC处理的星形胶质细胞在0和3小时，在KEGG通路数据库中分类的信号转导通路的变化。数据表明，mTOR信号通路的下调可能是中间神经保护亚状态发生的原因。进一步研究发现，mTOR抑制剂雷帕霉素或ITC治疗非反应性星形胶质细胞可以诱导神经保护亚状态，其标记物表达模式与ITC治疗相似。然而，雷帕霉素单独使用引起的神经毒性亚状态标记物表达变化较小，且与ITC诱导的变化不同。雷帕霉素刺激的星形胶质细胞不会像ITC治疗那样从神经保护状态转变为神经毒性状态，这可能是因为ITC刺激同时触发了多个信号通路的变化，而雷帕霉素特异性抑制mTOR信号通路，主要参与神经保护亚状态的诱导，而非其向神经毒性状态的转变。
研究者同时用mTOR激活剂MHY1485和ITC刺激非反应性星形胶质细胞。结果显示，单独用MHY1485治疗星形胶质细胞对典型的神经保护亚状态标志物Clcf1、Ptx3、Ptgs2和S100a10的表达水平没有显著影响。然而，当与神经炎症刺激ITC共同处理时，MHY1485显著下调了神经保护亚态标志物的表达。
这些数据表明，神经炎症刺激触发的反应性星形胶质细胞的神经保护亚状态的诱导是通过mTOR信号通路控制。
6、mTOR下调可减轻星形胶质细胞的神经毒性
由于雷帕霉素治疗可以诱导星形胶质细胞表现出神经保护状态，研究者接下来研究这种保护状态是否可以抵消ITC诱导的神经毒性作用。研究者首先将WT小鼠注射雷帕霉素2天，然后注射LPS，以及可以在星形胶质细胞中特异性表达的AAV-sGFAP-mCherry-WPRE注射到小鼠大脑的SNc中，诱导神经毒性亚态星形胶质细胞的激活。结果显示，注射雷帕霉素的小鼠中神经毒性亚状态标志物C3和泛反应性标志物GFAP的表达明显低于注射溶剂的对照组。此外，注射雷帕霉素的小鼠黑质中酪氨酸羟化酶阳性神经元的数量明显高于对照组，提示雷帕霉素治疗可降低pd样小鼠模型中反应性星形胶质细胞的神经毒性。进一步地，通过给3个月大的5XFAD小鼠连续2个月的雷帕霉素治疗，发现雷帕霉素显著抑制了5XFAD小鼠海马星形胶质细胞中泛反应标记和神经毒性亚态标记的表达，而对神经保护亚态标记的表达无显著影响。此外，雷帕霉素治疗还抑制了5XFAD小鼠海马的神经元变性，这些结果表明，雷帕霉素治疗也可以抑制AD小鼠模型中神经毒性星形胶质细胞的激活，抑制神经元变性。
而为了研究特异性下调星形胶质细胞中mTOR表达是否能减少神经元死亡。研究者设计了一个AAV介导的星形胶质细胞特异性shRNA表达系统来特异性下调星形胶质细胞中mTOR的表达。在LPS诱导的PD样模型中，特异性降低星形胶质细胞中mTOR的表达水平可以抑制神经毒性亚状态标记物的表达，而对神经保护亚状态标记物的表达无显著影响。重要的是，星形胶质细胞特异性mTOR的下调还抑制了多巴胺能神经元的死亡。这些结果表明，在星形胶质细胞中抑制mTOR的活性或表达可以有效减少神经退行性疾病进展过程中的神经元死亡。
三、全文总结
研究揭示了星形胶质细胞在神经炎症条件下的动态亚状态转变过程，从非反应性状态先转变为神经保护性亚状态，再进一步转变为神经毒性亚状态，这一过程受mTOR信号通路调控。研究通过多种实验方法，包括转录组测序、单细胞RNA测序、蛋白质组分析和动物模型实验，证实了mTOR信号通路的抑制可以诱导神经保护性亚状态并抑制向神经毒性亚状态的转变，从而减轻神经毒性效应并保护神经元。此外，研究发现阿尔茨海默病模型和正常衰老过程中星形胶质细胞的神经保护性和神经毒性亚状态比例失衡，与疾病进展和认知功能下降相关。这些发现强调了重新审视星形胶质细胞异质性的重要性，并提出了通过调节mTOR信号通路干预星形胶质细胞亚状态转变作为治疗神经退行性疾病的潜在新策略。
原文链接：
https://doi.org/10.1038/s43587-024-00792-z