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2025年5月10日，烈冰生物助力南京医科大学陈琪教授团队、贲晶晶教授团队、江斌教授团队，在《Nature Communications》在线发表题为“Endothelial major vault protein alleviates vascular remodeling via promoting Parkin mediated mitophagy”的研究论文。本研究中单细胞实验以及数据分析平台由烈冰生物提供。
发表日期：2025年5月
发表期刊：Nature Communications
影响因子：IF=14.7
一、研究背景与方法
1、研究背景
许多重要的血管疾病，包括新生内膜增生和动脉粥样硬化，其特征是内皮细胞损伤引发的病理血管重塑，但其内在调控机制尚未完全明了。本研究通过雄性小鼠血管疾病模型探讨了主要穹窿蛋白（MVP）在调节血管重塑中的作用，发现内皮MVP缺失会增加新生内膜形成并促进动脉粥样硬化。机制上，MVP直接与Parkin结合，通过解离E3连接酶NEDD4L从而抑制Parkin的泛素化和蛋白酶体降解，激活内皮细胞中的Parkin介导的自噬途径。研究表明，MVP/NEDD4L/Parkin轴可能成为治疗内膜增生和动脉粥样硬化的潜在治疗靶点。
2、研究方法
试验设计
从MvpECWT（对照）和MvpECKO（MVP在内皮细胞中特异性敲除）雄性小鼠的左颈动脉中分离细胞（n=2）
单细胞捕获平台：
烈冰PanoCell蜂巢板+BD Rhapsody
主要技术手段：
单细胞RNA测序（scRNA-seq）、全转录组RNA测序（RNA-seq）、流式细胞分选、免疫荧光（IF）、免疫组化（IHC）、Western blot等。
分析方法：
聚类分析、细胞类型注释、基因差异分析、功能富集分析、拟时序分析等；本研究使用烈冰单细胞转录组数据分析云平台--CytoNavigator®进行单细胞数据分析。
CytoNavigator®单细胞转录组数据分析系统是烈冰开发的单细胞分析与可视化平台。平台界面友好，不仅提供全面的生物信息数据分析工具，还提供高质量的数据可视化展示，分析高度可定制化，大幅度加速用户挖掘生信数据，降低了单细胞测序技术的使用成本和应用门槛，方便更多科研和临床学者开展单细胞测序工作,助力挖掘数据背后的生物学意义。
二、主要结果
1.血管疾病中内皮MVP上调
为了研究主要骨髓蛋白（MVP）在血管疾病中的作用，研究者通过免疫组化染色（IHC）发现MVP在颈动脉粥样硬化斑块中较无斑块动脉上调（图1A)，且与GEO数据库结果一致（图1B-D）。加权基因共表达网络分析（WGCNA）识别出两个与MVP表达相关性最高的模块（图1E），一个与内吞、炎症反应和巨噬细胞激活有关，另一个涉及血管结构、生成、内皮细胞迁移和凋亡等内皮细胞功能（图1F、G)。
进一步实验表明，西方饮食喂养的小鼠主动脉根部CD31⁺内皮细胞和CD31⁻细胞中MVP表达增加（图1H)；左颈总动脉结扎的小鼠模型中，结扎动脉的MVP表达增加且主要存在于CD31⁺内皮细胞中（图1I、J)。此外，体外培养的人脐静脉内皮细胞和主动脉内皮细胞在TNF-α刺激下MVP水平上升。这些结果表明，MVP在血管疾病中内皮细胞功能相关且表达上调。
2. 内皮MVP改善新生内膜增生和血管重塑
研究者利用他莫昔芬诱导的内皮MVP敲除小鼠模型（MvpECKO）评估MVP对血管疾病的影响。左颈总动脉结扎4周后（图2A)，雄性MvpECKO小鼠的新内膜面积、内膜与中膜比值及狭窄程度显著增加，但中膜和总体血管面积未变（图2B、C）。
进一步研究发现，内皮MVP敲除的MvpECKOApoe−/−小鼠在西方饮食喂养14周后，血浆胆固醇和甘油三酯水平未变（图2E)，但动脉粥样硬化病变面积、脂质积聚、坏死核心面积增加（图2F-J)，同时CD68+巨噬细胞增多而α-SMA+平滑肌细胞减少（图2K、L），表明内皮MVP缺乏加速了动脉粥样硬化。此外，低氧处理的MvpECKO小鼠出现肺动脉高压和右心室收缩压升高，肺动脉小动脉阻塞加剧，显示内皮MVP缺乏加重了肺血管重塑和肺动脉高压。
3.内皮MVP缺乏引起新生内膜细胞组成和表型的变化
为表征内皮MVP缺乏对动脉结扎诱导的细胞组成和表型变化的影响，研究者对分离的颈动脉中的13,835个细胞（MvpECWT中的7327个细胞和MvpECKO小鼠中的6508个细胞）进行了单细胞RNA测序（scRNA-seq）（图3A)。基于典型标记表达的聚类算法产生了17个不同的聚类，涵盖10种主要细胞类型（图3B、C）。内皮MVP敲除导致细胞比例变化，特别是SMC数量从MvpECWT小鼠的9%显著增加到MvpECKO小鼠的13.8%（图3D、E）。内皮MVP缺失还导致三种SMC亚群比例显著变化（图3F)，其中SMC3簇（类似软骨细胞的SMC）显著增加，从0.4%升至11.6%（图3G、H）。
拟时序分析证实SMC经历从SMC1到SMC3的有序进展路径。这些结果表明，内皮MVP缺乏可能在新生内膜形成的背景下促进SMC表型向软骨细胞样细胞的转变。此外，通过重新聚类EC队列识别出四个EC亚群（图3I、J），EC1簇，富含成纤维细胞基因（Fn1、Dcn和Col5a2），被注释为类似成纤维细胞的内皮细胞，在MvpECKO小鼠中增加。EC2簇，富含脂质代谢调节基因（Fabp4和Cd36），具有脂质摄取和代谢的功能特化；EC4簇，表达Lyve1基因，定义为淋巴样内皮细胞，在内皮MVP消融后比例没有明显变化。EC3簇，富含即刻早期基因（IEGs）转录本，包括Fosb、Fos和Id2，代表单细胞分离的产物在减少（图3K）。MVP缺乏增加内皮细胞凋亡表现为凋亡基因如Bcl2l11和Ecscr的表达增加（图3L)，相关基因表达上升，“内皮细胞凋亡过程的正向调控”通路富集（图3M)。结果表明，内皮MVP缺乏可能促进SMC表型向软骨细胞样细胞转变，并加剧结扎诱导的内皮细胞凋亡和转分化等。
4. MVP抑制小鼠血管疾病内皮细胞凋亡
为了探究内皮MVP在血管重塑早期的作用，研究者对7天结扎颈动脉的样本进行单细胞RNA测序，发现内皮MVP缺失使凋亡基因（如Birc5、Akt1和Nras）上调（图4A），且“凋亡”是上调基因中最富集的GO条目（图4B)。培养的HUVECs全转录组RNA测序（RNA-seq）显示，通过转染携带MVP短发夹RNA（shRNA）的慢病毒载体敲低MVP后，凋亡途径成为前五位富集的通路之一（图4C-E），流式细胞术和Western blot证实MVP敲低加剧了TNF-α诱导的内皮细胞凋亡加剧（图4F、G）。此外，MVP敲低还增加了TNF-α诱导的促凋亡蛋白裂解半胱天冬酶3的表达，并增加了末端脱氧核糖核酸转移酶dUTP缺口末端标记（TUNEL）阳性细胞的数量（图4H、I）。
体内研究也显示，内皮MVP消融增加了结扎颈动脉和WD喂养Apoe−/−小鼠主动脉壁中的内皮细胞凋亡（图4J-M），表明MVP可能抑制小鼠血管疾病中的内皮细胞凋亡。
5. MVP通过促进内皮细胞的有丝分裂来抑制氧化应激
为了理解MVP抑制内皮细胞凋亡的机制，研究者通过二氢乙锭DHE荧光染色发现内皮MVP缺失增加了结扎动脉和WD喂养的Apoe−/−小鼠主动脉中的ROS积累（图5A、B)，且敲低MVP增加了TNF-α诱导的培养内皮细胞中的ROS生成及线粒体ROS（图5C-H）。进一步研究发现，MVP敲低加剧了TNF-α诱导的内皮细胞线粒体数量增加，降低了线粒体膜电位（MMP），表明MVP对线粒体功能具有保护作用。
JC-1染色证实了内皮MVP敲除对结扎颈动脉和WD喂养主动脉中MMP的不利影响（图5I、J），使用线粒体ROS清除剂Mito Q可有效阻断MVP引起的HUVECs裂解半胱天冬酶3水平下降（图5K），表明MVP可能通过抑制线粒体ROS积累来防止凋亡。
通过分析MVP敲低的HUVECs中基因的GO富集情况，发现MVP敲低主要破坏了线粒体中的自噬过程（图6A），且MVP敲低抑制了线粒体自噬诱导剂氰基氯苯腙CCCP诱导的线粒体自噬，减少了线粒体自噬小体和自噬溶酶体的数量(图6B、C)。体内观察也验证了内皮MVP消融导致线粒体与自噬小体的共定位减少以及WD喂养的Apoe−/−主动脉中的情况（图6D-G）。此外，通过测量mt-Keima转染的细胞中的线粒体自噬流，发现MVP可能促进线粒体自噬体的形成而非与溶酶体的融合（图6H-L），这一假设通过线粒体自噬抑制剂CsA能够阻断MVP在HUVECs中的抗凋亡作用得到验证(图6M)。综上所述，这些数据证明了MVP促进内皮细胞线粒体自噬，从而抑制内皮细胞凋亡。
6. MVP与Parkin结合以防止NEDD4L介导的Parkin降解
为了揭示MVP调控线粒体自噬的分子机制，研究发现MVP能特异性地与Parkin通过共免疫沉淀相互作用（图7A、B)，并且这种相互作用在小鼠和人类动脉粥样硬化斑块中表现为共定位（图7C、D)。研究发现MVP敲低降低了Parkin蛋白水平而非mRNA水平（图7G)，而使用环己烷（CHX），一种蛋白质合成抑制剂，导致细胞内Parkin的丢失，而这种丢失被MVP过表达延迟（图7H)，这表明MVP作用于细胞内Parkin的机制与蛋白质合成无关。此外，MVP沉默诱导的Parkin下调被蛋白酶体抑制剂MG132处理减弱（图7I)。进一步的机制研究表明，MVP过表达能够抑制Parkin的K48-泛素化（图7J、K)，从而维持Parkin的稳定性，并促进其向线粒体的转运及线粒体自噬（图7L)。
此外，生物信息学平台预测发现NEDD4L是Parkin的E3连接酶，NEDD4L能直接与Parkin结合并促进其泛素化，而MVP过表达则抑制了Parkin与NEDD4L的相互作用及Parkin的泛素化（图7M、N）。这些结果表明，MVP通过与NEDD4L竞争结合Parkin，抑制Parkin的泛素化和降解，从而维持Parkin的稳定性并促进线粒体自噬。
7.Parkin的过表达可挽救MVP缺乏引起的新生内膜形成中的血管重塑
体外实验显示，过表达Parkin能显著改善MVP敲低引起的自噬停滞（图8A），并逆转MVP敲低导致的TNF-α处理细胞中裂解半胱天冬酶3水平升高（图8B)，表明Parkin是MVP介导的内皮细胞自噬的关键中介。
此外，采用EC特异性ICAM2启动子驱动的AAV9编码Parkin转染MvpECKO小鼠来研究内皮MVP-Parkin轴对体内血管重塑的影响（图8C)，发现Parkin过表达可逆转内皮MVP缺失导致的新生内膜增生（图8D-G）和内皮细胞凋亡，并激活巨噬细胞吞噬，这是由于MvpECKOCD31+EC中线粒体与自身吞噬体的共定位增加所导致的（图8H、I）。
进一步在MvpECKO小鼠中转染AAV-MVP，发现MVP的强制表达降低了结扎诱导的颈动脉新生内膜形成、内膜面积和内膜与中膜的比率，而对中膜面积的影响很小（图9A-C）。
值得注意的是，EC中MVP的再表达降低了TUNEL染色的频率，同时LC3B和COXIV共染色的强度增加。EC中Parkin的敲除明显逆转了MVP再表达的所有这些影响（图9D-G）。这些结果强调，内皮MVP通过促进Parkin介导的有丝分裂和抑制凋亡来缓解新生内膜增生。
研究结论
MVP在内皮细胞损伤诱导的血管重塑中发挥重要作用，通过与Parkin相互作用并阻止Parkin被NEDD4L降解，维持Parkin稳定性，促进Parkin介导的线粒体自噬，保护内皮细胞免于凋亡，进而抑制新生内膜增生和动脉粥样硬化进展。MVP/NEDD4L/Parkin轴可能成为预防和治疗血管疾病的新靶点，但其在人类研究中的应用及潜在副作用还需进一步探索。
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