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【烈冰助力】单细胞转录组分析COVID-19与结核病共感染的免疫反应
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烈冰生物助力首都医科大学附属北京胸科医院的王桂荣主任、杨新婷主任和首都儿科研究所实验中心王毅主任，在《Exploration》在线发表题为“Single-Cell Transcriptomic Analysis of the Immune Response to COVID-19 and Tuberculosis Coinfection”的研究论文。烈冰生物为本研究提供了单细胞测序实验服务。
发表日期:2025年5月
发表期刊：Exploration
影响因子：IF=22.5
1、研究背景
2020-2022年，COVID-19死亡率位居全球单一传染源死因首位，其特征涵盖血清促炎细胞因子升高、淋巴细胞减少等。高龄等基础问题与不良预后相关，约14.3%的重症患者会有继发细菌感染，其中结核病被确认为加重疾病严重程度的风险因素。结核病与COVID-19具有相似的传播特征，且均表现出免疫应答失调的现象，但关于COVID-19对结核病预后影响（反之亦然）的数据仍十分有限。已有研究发现共感染患者对两种病原体的免疫应答能力均下降，单细胞 RNA 测序技术可助力揭示传染病的复杂免疫反应和细胞相互作用，本研究利用该技术对共感染患者的外周血单个核细胞进行分析，以加深对共感染时致病性宿主免疫反应的理解。
2、研究方法
实验设计：
健康对照组（Heal）：n=6
COVID-19和结核病共感染患者组：轻症组（Mild）：n=8、重症组（Severe）：n=3
单细胞捕获平台：
10x Genomics
主要技术手段：
单细胞测序、流式细胞术、血浆细胞因子检测等。
分析方法：
细胞聚类分析、差异表达基因分析、细胞通讯分析、拟时序分析等。
1. 共感染患者的单细胞转录组分析
为探究COVID-19与结核病共感染的免疫学机制及发病机理，研究者利用单细胞RNA测序技术分析了17份外周血单个核细胞样本，来自6例健康志愿者及11例不同临床严重程度的COVID-19-TB共感染患者（8例轻症和3例重症）（图1A）。通过10× Genomics平台捕获113,601个细胞，经严格质控后保留97,600个单细胞，平均每个细胞检测到6158个UMI，涵盖1987个基因（图1B）。之后鉴定出九种主要细胞类型：B细胞、CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、γδT细胞、MAIT细胞（黏膜相关恒定T细胞）、NK细胞（自然杀伤细胞）、树突状细胞（DCs）、单核细胞（Mono）及巨核细胞（Mega），这些细胞类型涵盖了外周血主要细胞群（图1C、D）。
同时研究发现重症患者中淋巴细胞（除浆细胞外的B细胞、CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、γδ T细胞、MAIT细胞及NK细胞）耗竭（图1E），而髓系细胞（单核细胞、巨核细胞和树突状细胞）富集（图1E）且这种淋巴细胞减少伴髓系细胞增多的现象在轻症共感染患者中未观察到（图1E）。方差分析（ANOVA）验证了细胞组成变化与疾病严重程度的关联性，B细胞簇和单核细胞簇分别与重症和轻症显著相关（图1F）。
2.疾病严重程度与PBMC组分的关联性
接着将 9 种主要细胞类型细分为 31 种细胞亚型，涵盖 B 细胞、T 细胞、NK 细胞和髓系细胞等亚型（图2A）。研究发现，重症共感染患者多数 B 细胞亚型耗竭，只有浆细胞富集（图2B），浆细胞高表达 CD38、MZB1、XPB1、PRDM1 和 JCHAIN 等基因，与轻症共感染组也关联紧密（图2C）。共感染患者体内浆细胞数量增加，尤其在重症患者中，可能促使机体产生针对 SARS-CoV-2 的中和抗体。在浆细胞亚型中，编码免疫球蛋白恒定区（IgM、IgG1、IgG2、IgA1 和 IgA2）的基因表达水平较高，这与其抗体产生的功能相契合（图2D）。与轻症患者和健康捐赠者相比，重症共感染患者体内 Ig 基因表达水平更高，暗示重症患者体内可能有高水平的 SARS-CoV-2 抗体。拟时序分析及 PAGA 图谱表明浆细胞可能来源于记忆 B 细胞，共感染患者记忆 B 细胞簇减少且与疾病严重程度相关（图2B,C）。T细胞亚群与疾病严重程度显著关联（图2C），多数 T 细胞亚型在重症组减少、轻症组增加，但两种 CD8+ T 细胞亚型（CD8_Pro 和 CD8_Effector - GZMK(+)）在所有共感染患者中均升高，以增殖标志物为特征的 CD8_Pro 细胞亚型与重症共感染显著相关，其可能来源于记忆CD8+ T细胞。与对照组相比，重症患者的CD8_Memory 细胞数量显著耗竭（图2B，E）；Th1细胞在轻度共感染患者中增加，重症患者则呈现下降趋势。进一步分析表明 Th1 细胞主要来源于 CD4_eMemory ，其在轻度共感染组中升高，但在重症组中减少，Th1 细胞及其前体细胞的耗竭表明重症共感染患者存在 Th1 反应失调。
与重症共感染患者的淋巴细胞减少相反，大多数髓系细胞亚型呈现增多趋势（图2B），该现象在单独感染结核病和新冠肺炎重症患者中亦有报道。分析表明不同髓系细胞亚型与共感染患者的临床结局存在差异关联（图2C），树突状细胞亚型与轻症显著相关，单核细胞亚型与重症密切相关。研究鉴定出髓源性抑制细胞（MDSCs）的特殊单核细胞亚型（Mono_MDSCs）（图2A），其特征是钙卫蛋白表达上调而MHC-II分子表达下调（图2G）。PAGA轨迹分析显示MDSCs可能源自经典单核细胞（Mono_CD14），与既往研究一致。MDSCs在多种炎症状态下增多并抑制T细胞应答，本研究中其在重症共感染组明显富集（图2B），提示重症共感染组的单核细胞具有高度MDSCs样特征。此外，还发现以高表达C1QA/B/C为特征的特殊单核细胞亚型（Mono_C1QA）（图2A），进一步研究证实该亚群是C1补体的主要外周来源（图2H），编码C1补体成分的基因在共感染组的表达水平显著高于对照组，提示C1补体成分可能对共感染具有诊断价值。最后，经典单核细胞（Mono_CD14）在健康对照与共感染患者间的UMAP投影模式呈现差异化（图2J），表明其转录组特征发生改变。
3. S100蛋白家族的特征研究
研究者发现共感染患者，特别是重症患者的细胞因子和炎症基因表达显著上调（图3A），提示可能存在炎症性细胞因子风暴。在共感染重症组中，四种细胞亚型（两个单核细胞亚群Mono_CD14和Mono_MDSCs、一个CD8+T细胞亚群CD8_Naïve和一个树突状细胞亚群DC_mDC）表现出显著升高的炎症和细胞因子评分，其中经典单核细胞（Mono_CD14）是炎症风暴的主要来源（图3B）。
进一步的分析显示，在重症患者中超过99%的细胞因子评分源于S100A6/8/9/11/12这5种细胞因子，且主要由Mono_CD14分泌（图3D，E），其中S100A8/9贡献了约80%的细胞因子评分。S100A8/9在炎症期间高表达，通过与Toll样受体4（TLR4）结合调节炎症反应，导致促炎细胞因子释放加剧炎症（图3G）。与轻症患者和健康供体相比，TLR4在重症共感染患者中的表达显著升高，尤其在炎症性单核细胞（Mono_CD14）中表现突出（图3G）。S100A8/9-TLR4信号通路通过招募并激活IRAKs及TRAF6，触发MyD88依赖性通路，放大炎症反应并导致严重组织损伤（图3G），该信号通路中关键基因的表达在重症共感染组也显著增加（图3G）。
此外，研究观察到重症组四个炎症细胞簇之间存在显著的配体-受体相互作用，主要炎症细胞亚群（Mono_CD14）表达多种受体，表明该细胞亚群能同时响应其他细胞释放的多种细胞因子，经典单核细胞与其他炎症细胞的相互作用可能主要依赖于多种特定通路（图3H）。研究者还检测了共感染患者血浆中30种细胞因子的浓度，发现多种促炎细胞因子在共感染患者中显著升高，包括重症组患者。这些发现表明重症共感染患者呈现S100A8/9-TLR4炎症特征，凸显了S100A8/9对于设计有效疗法以缓解重症患者免疫病理机制的重要性。
4.重症共感染患者的T细胞应答失调
对共感染患者的T细胞转录组分析发现，与健康对照组相比，轻度和重度共感染组分别有192个和149个上调的差异表达基因（DEGs），其中78个为共有。这些基因主要涉及"γ-干扰素反应"和"I型干扰素反应"通路，与针对结核病和病毒感染的免疫反应一致（图4A）。重症患者的T细胞还表现出与"中性粒细胞趋化、脱颗粒和活化"及"炎症反应"相关的Go富集（图4B），提示其可能具有促炎特性。
此外，共感染患者的T细胞表现出更高的细胞毒性状态，尤其是重症组（图4C），其中多个T细胞亚群（如CD8_Memory、CD8_eMemory、MAIT细胞和γδ T细胞）的细胞毒性基因（如IFNG、NKG7、GNLY、GZMA、GZMB和KLRD1）显著上调，尽管颗粒酶对于杀灭病原体或病原体感染的细胞至关重要，但其过表达可能通过破坏细胞外基质和引发炎症导致免疫病理学改变。同时，穿孔素/颗粒酶通路相关基因（如GZMA、GZMB、GZMK、GNLY和CASP3）在共感染患者中显著上调，其中重症患者表达水平最高（图4E），除穿孔素/颗粒酶相关通路外，TNF、FAS和IRF1通路也可能导致T细胞凋亡，因此研究者对此进行了研究（图4F）。
研究还发现，重症患者的T细胞耗竭评分显著增加，多个T细胞亚群（如CD4_Th1、CD8_效应细胞-GZMK(+)、CD8_效应细胞-GZMK(-)、CD8_效应记忆细胞、MAIT细胞和γδT细胞）表现出显著的耗竭特征，表明这些亚型可能是关键的耗竭性T细胞（图4G），可能与高表达的抑制性分子（如PD1、CD200、HAVCR2、CTLA4、CD80和TIGIT）相关（图4H）。最后，共感染患者的T细胞迁移活性增强，但重症与轻症患者间未见明显差异（图4I,J），迁移相关基因（如CXCL17、XCL2、CXCL13、CXCL2、CXCL8）在共感染患者中高表达。与T细胞相比，共感染患者的NK细胞也表现出与细胞毒性、细胞凋亡和细胞耗竭相关的基因高表达，但未出现耗竭现象（图4K）。
5.共感染患者的B细胞异质性
研究者对共感染患者的B细胞亚群分析显示，B_plasma细胞在重症患者中显著增加，表明保护性SARS-CoV-2中和抗体的产生，而其他B细胞亚群则减少。功能分析揭示共感染组B细胞中与蛋白质复合体组装、转运和修饰相关的通路富集，暗示大量抗体生成（图5A、B）。IgA和IgG水平在共感染患者中高于健康供体（图5C），重症患者中尤为显著。
此外，B细胞活化、分化及增殖相关信号通路在共感染患者中显著富集（图5B），关键基因（如FCER2、PRDM1、IRF4、CD86和EBI3等）表达特征表明初始B细胞和记忆B细胞的活化（图5D，5E）。浆细胞中关键转录因子IRF4、XBP1和PRDM1的表达上调，其中重症组表达水平最高（图5F），支持重症患者可能具有更高抗体水平的假说。共感染患者中CD4+ T细胞上CD2AP表达增加，可能调节滤泡辅助性T细胞分化并增强抗病毒抗体应答。
同时，TNFSF14和KDM5A的表达增加，表明T细胞和B细胞的激活。与健康供体相比，共感染患者的B细胞亚群中IFN-I反应信号通路相关基因显著富集，提示轻症患者可能产生更强的干扰素反应。重症患者的B细胞中炎症反应通路和中性粒细胞活化相关通路尤为富集，表明该组B细胞可能存在炎症特征。通过分析炎症特征基因，研究者发现各B细胞亚群呈现不同的炎症状态，其中初始B细胞（B_Naïve）和浆细胞（B_Plasma）亚群的炎症评分较高（图5G）。与此一致的是，参与炎症反应的基因（如S100A8/9/12）在重症患者中表达上调（图5H）。这些发现表明重症患者的B细胞具有炎症特征，可能加剧该组的炎症反应。最后，轻症和重症共感染组中多个HLA II类基因表达下调，提示适应性免疫细胞间的互作可能存在失调。
6. 共感染患者髓系细胞的重塑
髓系细胞被聚类为8种亚型，分属单核细胞、巨核细胞和树突状细胞三大谱系（图1、图2）。经典单核细胞（Mono_CD14）作为外周髓系细胞的主要组成部分，在重症组触发细胞因子风暴中起核心作用，其在合并感染组中显著升高，重症组中增加最明显。重症组表现出最强的炎症反应，意味着过度炎症可能推动共感染患者疾病进展（图6B）。巨核细胞在止血中起关键作用，但共感染患者体内与血小板聚集和活化相关的GO通路未显著上调，提示血栓形成风险低，且未观察到促炎细胞因子上调，与之前观察一致，表明其在驱动细胞因子风暴中作用有限。经典树突状细胞（mDCs）作为专职抗原呈递细胞，轻度患者mDCs的抗原呈递和吞噬能力高于健康供体，但重症患者中较低（图6D，E）。HLA分子（尤其是II类分子）在轻症患者中表达上调，重症组中下调，吞噬作用相关基因表达水平在轻症患者中升高，重症患者中降低。
此外，调控mDCs发育与功能的转录因子在重症患者中表达水平低（图6D，E），表明重症患者mDCs可能处于免疫瘫痪状态。浆细胞样树突状细胞（pDCs）在病毒感染时产生I型干扰素，重症合并感染患者IRF7/8表达水平显著降低（图6F），其他干扰素相关基因也下调，提示pDCs功能失调。最后，与pDCs发育和功能相关的基因异常，如CD62L、NRP1和BCL11A在重症组表达低，暗示pDCs发育与分化受阻。
总结
综上所述，本研究全面揭示了结核病与新冠肺炎合并感染时的单细胞转录组免疫应答图谱。研究结果阐明了合并感染特有的分子与细胞免疫特征，并发现重症病例存在全身性免疫失调状态。这些发现为理解结核病与新冠肺炎合并感染的免疫发病机制提供了重要见解，有望为该患者群体新型治疗策略的开发提供依据。