近期，中国中医科学院广安门医院姜泉主任医师及其研究团队在期刊《Journal of Translational Medicine》在线发表了题为“Identification EXOSC4 as a novel autoantigen of interstitial lung disease in rheumatoid arthritis”的研究论文，中国中医科学院广安门医院风湿病科姚传辉博士为本文的第一作者，烈冰生物提供NovelCyto单细胞捕获实验支持。

发表日期： 2025年7月

发表期刊：Journal of Translational Medicine

影响因子：IF=7.5

一、研究背景和方法

1、研究背景

间质性肺病（ILD）是类风湿关节炎（RA）的常见且严重的并发症，但目前仍缺乏可靠的诊断生物标志物。II型肺泡细胞（ATII）在ILD的发病机制中起着关键作用，这一点已得到广泛认可。本研究首先旨在利用ATII细胞筛选并验证可能参与RA-ILD的自身抗原。

2、研究方法

实验设计：

3 例 RA-ILD 患者的pbmc：3 例正常肺： 3 例 IPF 肺

单细胞捕获平台：

NovelCyto单细胞捕获系统

主要技术手段：

单细胞RNA测序（scRNA-seq）、Co-IP + DIA-LC-MS/MS、Western blot、免疫组化（IHC）等。

分析方法：

聚类分析、细胞类型注释、基因差异分析、细胞通讯分析等。

二、主要研究内容

1. EXOSC 4是RA-ILD患者潜在的自身抗原

研究初期，研究者分别从健康个体、类风湿关节炎非间质性肺病（RA-non-ILD）患者和RA-ILD患者各五例中采集外周血清样本，并设置两个空白对照组用于ATII细胞免疫共沉淀实验。随后通过Pro DIA定量蛋白质组学分析，旨在鉴定ATII细胞内的潜在抗原。该分析共获得1,117种可定量蛋白及8,464条肽段。通过主成分分析（PCA）评估实验稳定性与样本分组情况，发现RA-ILD组与其他组别存在显著差异。不同组间抗原表达呈现显著差异（图1A）。根据|log2FC|>1且P<0.05的差异表达标准，在RA-ILD组与RA对照组对比中鉴定出68种差异表达抗原，其中56种表达量升高，12种表达量降低（图1C）。

图1

进一步分析显示，RA-ILD组EXOSC4的表达水平显著高于RA-非ILD组，具有高度特异性（图1B）。既往研究表明，RNA功能改变是肺纤维化的关键机制之一，而吸入RNA疗法在治疗该病症方面也展现出潜力。作为RNA外切体复合物的核心组分，EXOSC4在核酸代谢中发挥着关键作用。因此，研究者推测外泌体小核糖核酸4（EXOSC4）可能是类风湿性关节炎相关间质性肺病（RA-ILD）的潜在抗原。基因本体论（GO）富集分析表明，RA-ILD的发病机制可能与核质转运、细胞外胞吐作用和RNA降解等信号通路相关，这进一步支持了EXOSC4作为RA-ILD潜在自身抗原的可能性（图1D）。

2. RA-ILD患者血清EXOSC4抗体水平升高

图2

研究者对ATII细胞来源的蛋白条带与不同患者血清进行孵育实验，在所有条带中发现一条与EXOSC4分子量相同的条带，该条带通过RAILD患者血清孵育获得（图2A）。为验证EXOSC4作为类风湿关节炎相关间质性肺病（RA-ILD）潜在自身抗原的假设，研究者采用微阵列扫描仪检测患者血清与EXOSC4抗原结合的信号强度。蛋白质芯片分析显示，RA-ILD患者的血清在与EXOSC4抗原结合时呈现最高信号强度（图2B）。为确保实验结果的可靠性，研究者扩大了样本量进行测试。通过ELISA法进一步比较不同患者血清中EXOSC4抗体水平。临床样本的详细信息见表1。研究结果显示，RA-ILD患者的EXOSC4抗体光密度值（OD）显著高于RA-non-ILD患者（P<0.01）和健康对照组（P<0.0001），如图2C所示。因此，研究者证实RA-ILD患者血清中EXOSC4抗体水平升高，确立了EXOSC4作为该患者群体自身抗原的特性。

3. CIA-BLM小鼠肺组织中EXOSC4的表达增加

图3

在这项研究中，DBA/1雌性小鼠被用于体内验证。首先，使用牛II型胶原建立CIA小鼠模型，并通过气管给药BLM溶液建立纤维化模型。肺组织苏木精和伊红（HE）染色显示，阴性对照（NC）组的肺结构基本正常，而CIA组表现出轻度异常，无水肿或炎性细胞浸润。相比之下，CIA-BLM组显示出严重的异常，包括大量炎性细胞浸润（图3A）。随后，利用IHC检测肺组织中EXOSC4的表达，显示核染色阳性。在CIA-BLM组中，观察到明显的肺泡上皮增生和肺泡腔的明显损伤，由于成纤维细胞组织增殖，肺泡腔广泛融合和闭塞。与NC和CIA组相比，EXOSC4阳性细胞的数量有所增加（图3B）。定量分析表明，CIA-BLM组的阳性面积明显大于CIA和NC组（P<0.01）（图3C）。这些发现表明，与CIA组相比，CIA-BLM组的EXOSC4表达显著增加。

4. ATII-BLM细胞中EXOSC4的表达增加

图3

研究者通过 BLM 干预 ATII 细胞，建立体外纤维化细胞模型。为研究 ATII细胞中 EXOSC4 抗原表达的变化，分别使用空白对照、RA-non-ILD、RA-ILD 患者血清及 EXOSC4 抗体孵育 ATII 和 ATII-BLM 细胞。如图 3D所示，ATII-BLM 细胞中抗原表达较 ATII 细胞明显增加。值得注意的是，RA-ILD 组的自身抗原表达模式与 EXOSC4 抗体组一致，均从细胞核转移到细胞膜上，并最终在细胞膜上大量表达。而 RA-non-ILD 组在自身抗原表达方面未出现类似的变化（图 3D）.定量分析显示，无论是在 BLM 干预前后，RA-ILD 组的相对平均荧光强度（MFI）均显著高于 RA-non-ILD 组和 NC 组（图 3E，F）。此外，在 BLM 干预后，空白对照组和 EXOSC4 组的相对 MFI 显著升高，但 RA-non-ILD 组和 RA-ILD组无显著差异（图 3G）。

5. EXOSC4抗体水平与PNI呈显著负相关

表1

如表1所示，类风湿关节炎合并间质性肺病（RA-ILD）患者的年龄显著高于RA-non-ILD患者（P<0.001），且发病年龄更大，与RA-non-ILD患者相比，其红细胞沉降率（ESR）、C反应蛋白（CRP）和乳酸脱氢酶（LDH）水平均升高（P<0.05）。此外，RA-ILD患者的预后营养指数（PNI）显著低于RA-non-ILD患者（P<0.01），而其他指标未见显著差异。

图4

为评估EXOSC4抗体水平的临床意义，研究者分析了临床数据与EXOSC4抗体OD值的相关性。在基础人口统计学因素方面（图4A），EXOSC4抗体水平与年龄呈低正相关（P=0.050，r=0.246），但与发病年龄、病程或体重指数（BMI）无显著相关性（P>0.05）。就疾病活动度而言（图4B），EXOSC4抗体水平与DAS28-CRP呈低正相关（P=0.033，r=0.267），但与DAS28-ESR、CDAI或SDAI无显著相关性（P>0.05）。在炎症标志物方面（图4C），EXOSC4抗体水平与CRP（P=0.002，r=0.299）和ESR（P=0.014，r=0.305）呈低正相关，但与血小板计数（PLT）无显著相关性（P>0.05）。未发现EXOSC4抗体与类风湿因子（RF）或抗环瓜氨酸肽抗体（anti-CCP）存在关联（P>0.05）（图4D）。值得注意的是，EXOSC4抗体水平与乳酸脱氢酶呈中等正相关（P=0.006，r=0.337），与PNI呈显著负相关（P<0.001，r=-0.705）（图4E）。

6. EXOSC 4抗体联合临床指标显著提高RA-ILD的诊断准确性

图5

研究者深入研究了EXOSC4抗体作为生物标志物的诊断潜力。通过整合现有文献数据和单变量分析结果，研究者绘制了乳酸脱氢酶（LDH）、发病年龄（AO）、预后营养指数（PNI）及EXOSC4抗体在区分RA-ILD与RA-non-ILD患者中的受试者工作特征（ROC）曲线，如图5所示。EXOSC4抗体的曲线下面积（AUC）为0.809（95%置信区间：0.704–0.913），显示出更优的预测能力。后续采用LDH、AO和EXOSC4抗体进行逻辑回归分析表明，这三种指标的联合应用显著提升了模型预测性能，AUC值达到0.890 (95%置信区间：0.812–0.967）。这证明EXOSC4抗体可作为RA-ILD的可靠诊断标志物。

7. Naïve CD4+T细胞与ATII细胞之间的互作可能影响EXOSC4抗体的产生

图6

为探究EXOSC4抗原产生的来源，研究者对外周血细胞与ATII细胞进行了相互作用分析。研究中，研究者从GEO数据库（编号GSE132771）获取了三例特发性肺纤维化（IPF）患者的单细胞数据，以及三例正常人肺组织样本作为对照组。首先对各类细胞进行聚类分析（图6A-C），随后解析其基因表达谱特征（图6D），最终系统考察了这些细胞与ATII细胞之间的相互作用关系。在图6E和F中，圆圈的大小表示细胞的数量，而线条的粗细反映了相互作用的强度。可以看出，Naïve CD4 + T与数量最多的ATII细胞相互作用。

鉴于异常细胞相互作用常与疾病发展中的关键信号通路激活相关，研究者初步推测Naïve CD4 + T细胞与ATII细胞之间的广泛相互作用可能参与某些重要信号通路。其中，与细胞增殖、分化及纤维化密切相关的Wnt/β-catenin信号通路被认为在其中起重要作用。进一步分析通过评估不同细胞类型中的Wnt/β-catenin信号通路发现，Naïve CD4 + T细胞在此通路中对ATII细胞的影响最为显著（图6G）。因此，研究者推测RA-ILD患者体内EXOSC4抗体水平升高，很可能是Naïve CD4 + T细胞与ATII细胞之间广泛相互作用的结果，而这种相互作用可能与Wnt/β-catenin信号通路的激活有关。

8. EXOSC4抗原可能通过激活Wnt/β-catenin信号通路引起RA-ILD

图7

为验证EXOSC4在类风湿关节炎相关间质性肺病（RA-ILD）患者中作为自身抗原的作用，研究者对ATII细胞的胞质EXOSC4表达进行了对比分析。如图7A所示，ATII-BLM细胞胞质中的EXOSC4表达量显著高于ATII细胞。通过初步机制探索发现，ATII-BLM细胞中α-SMA、Wnta3a和β-catenin的表达水平较ATII细胞有所升高（图7B）。多因子分析显示，RA-ILD患者血清中的IL-10和IL-27水平显著降低，而IL-15和Rantes水平则明显高于健康对照组及RA-non-ILD患者（图7C）。因此，研究者认为EXOSC4可能通过激活Wnt/β-catenin信号通路参与RA-ILD的发病机制，该通路与初始CD4+细胞与ATII细胞的相互作用密切相关。

三、总结

本研究确定了EXOSC4是RA-ILD中的一种新型自身抗原，并提供了其诊断和机制意义的初步证据。虽然需要进一步的研究来充分了解其作用，但研究者的发现为RA-ILD的诊断工具和靶向治疗开辟了新的途径。