Hi，大家好，我烈小冰回来啦！

久别重逢，伴手礼怎么能少？

快来看看烈小冰家新鲜出炉的重磅单细胞研究

胰腺癌，是公认的最致命的恶性肿瘤之一，其5年生存率仅为9%，是名副其实的“癌王”。由于胰腺癌的高基质密度对T细胞浸润产生了物理屏障，因此现阶段的免疫检查点抑制剂和嵌合抗原受体T细胞疗效甚微。因此，针对固有免疫系统的治疗干预可能为目前PDAC免疫疗法的替代方案。

既然T细胞无法打入“敌人”内部，擅长“肿瘤谍战”的专家们决定采取迂回战术，尝试从肿瘤内部寻找突破口，瓦解“敌人”的组织。而肿瘤内部微环境中存在的中性粒细胞有可能是可被“策反”的对象，肿瘤相关中性粒细胞（TANs）作为其中的“关键人物”，参与促进肿瘤细胞增殖，血管生成，组织重塑，免疫抑制和转移等多项工作，TANs的浸润也被认为是影响肿瘤的最不利的预后因素之一。但也有证据表明中性粒细胞也表现出对肿瘤细胞的直接细胞毒性或抗体依赖性细胞毒性以对抗肿瘤进展，因此是否能够对其“策反”成功尚不清楚，需要对其进行进一步“考察”。

烈冰生物合作伙伴——上海交通大学医学院附属瑞金医院沈柏用教授团队针对上述问题开展了系列研究，于近期在GUT(IF=23.06）上发表了题为Single-cell RNA-seq analysis reveals BHLHE40-driven pro-tumour neutrophils with hyperactivated glycolysis in pancreatic tumour microenvironment的研究论文。王俐文博士后为本研究的第一作者，沈柏用教授、陈赛娟教授、蒋玲曦教授为通讯作者，该研究提供了胰腺导管腺癌（PDAC）肿瘤微环境中性粒细胞的综合图谱。发现了驱动中性粒细胞朝向促肿瘤亚型的分子机制，该研究成果将有助于开发针对PDAC患者的新型免疫疗法，为“策反”中性粒细胞提供新的思路。

发表日期：2022年6月

发表期刊：Gut

影响因子：23.06

烈冰生物参与了本研究中的单细胞测序和数据分析工作，下面我们一起了解一下本文的研究思路和数据分析过程吧~

单细胞测序实验设计

5名PDAC患者的外周血和PDAC组织、2名健康人（HC）的外周血、2名胰腺炎患者（CP）外周血样本，分离血液CD66b+中性粒细胞（PMN）和胰腺癌组织 CD45+免疫细胞

单细胞捕获平台：BD Rhapsody

单细胞实验分组：HC-PMN（健康组）x2；CP-PMN（慢性胰腺炎组）x2；PDAC-PMN细胞x5； PDAC免疫细胞x5。

主要技术手段：单细胞测序，空间转录组测序，转录组测序，蛋白组、代谢组质谱分析，免疫荧光，免疫组化,pcr（qpcr）分析

单细胞分析工具应用：细胞聚类分析，subCluster分析，差异基因表达分析，GO/Pathway分析，拟时序分析，SCENIC分析，cellphone分析等。

研究成果解析

01中性粒细胞的异质性

基于前期队列研究发现，TANs在PDAC中大量浸润，且与PDAC患者预后不良相关。利用单细胞测序，研究者共检测到33891个外周血中性粒细胞和17932个胰腺癌免疫细胞的转录组，进一步划分8种细胞类型，其中中性粒细胞存在两个细胞群体：Neutrophils 1存在于外周血样本，Neutrophils 2仅存在于肿瘤组织中。CellphoneDB分析发现，相较于其他的免疫细胞，巨噬细胞与TANs间存在大量的配受体关系对，如CCL13-CCR1,CCL3-CCR1等，表明肿瘤微环境中两种细胞间的紧密相互作用，这也与免疫荧光染色中TANs和巨噬细胞间的物理距离接近的结果相互印证。

02 TANs异质性分析

为了进一步研究中性粒细胞的异质性，烈冰为研究者提供了subCluster分析，对PDAC患者的中性粒细胞细分，获得了6个PMN亚群和6个TAN亚群，PMNs表现出相似的表达特征，而TANs存在异质性：TAN-1亚群高表达血管生成因子VEGFA、促转移因子PLAU、LGALS3等，表现为促癌的特征；TAN-2与炎症相关（表达NLRP3、CD69和IL1RN等基因）；TAN-3的基因表达特征和PMNs类似且高表达与中性粒细胞跨内皮迁移相关的基因（VNN2和SELL），说明TAN-3可能是迁移到肿瘤微环境中的过渡态细胞；而TAN-4特征性地高表达干扰素刺激基因。

03 TAN-1与PDAC患者不良预后相关

鉴于TAN-3的过渡态特征，研究者应用monocle2算法进一步构建了中性粒细胞状态轨迹的伪时间图，以PMN为分化的起点，逐渐转化为TAN-3过渡态，随后经过TAN-0和TAN-4的状态，最后达到终末分化状态TAN-2和TAN-1。研究者找到了1757个随拟时轴显著变化的基因并可归类为3种表达模式，其中第3组基因在肿瘤微环境晚期被激活，并在缺氧、糖酵解、内质网（ER）应激、IL-1和TNF信号通路等过程富集。进一步，研究者利用ER应激诱导剂（毒胡萝卜素 THG)、促炎细胞因子IL-1β和TNFα以及缺氧的方式，体外刺激了中性粒细胞样分化的HL-60（dHL-60）细胞，发现内质网应激和缺氧是诱导中性粒细胞向TAN-1表型分化的关键因子。

此外，免疫荧光和免疫组化染色证实在PDAC微环境中存在上述4个亚群。有趣的是，VEGFA+ TANs（TAN-1）通常位于癌细胞附近，使其能够发挥促肿瘤功能。结合多个临床数据的进一步分析显示，VEGFA+ TANs和PDAC患者的不良预后显著相关。