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生命体是个错综复杂的网络，任何一类RNA分子都不是独立存在的，越来越多的研究团队发现长RNA可以通过“miRNA 海绵”机制结合和吸附部分互补的miRNA，从而间接调控miRNA靶基因的表达。
CRISPR-Cas系统是原核生物一种抵御外来入侵核酸的免疫系统，已被广泛用于遗传育种、新药开发、疾病治疗、动物模型构建、转录调控以及分子诊断等各领域的基因组编辑中，被誉为在后基因组时代开创了遗传疾病精准治疗的新时代。
烈冰生物合作伙伴——海军军医大学王越教授团队、上海交通大学医学院附属第九人民医院秦兴军/王业飞合作团队与美国南加州大学应其龙团队合作在《Molecular Cancer》杂志（IF=41.444）上发表Cas9 RNA新机制解析和新应用开发的研究成果。
基于基因编辑技术和RNA-seq，团队发现了外源性长链核酸物质Cas9 RNA可通过miRNA海绵机制影响宿主细胞基因表达，并开发了RNA序列优化策略，以提高该基因编辑系统的安全性。烈冰生物提供了研究中的RNA测序和部分生物信息数据分析支持。
结果解析
Cas9 RNA通过 miRNA 海绵机制影响宿主细胞基因表达
为了分析 Cas9 对其预测的结合microRNA及其靶基因的调节作用，团队从331个细胞系中导入Cas9的细胞的转录特征数据库中提取了各基因的RNA表达数据及其对应的亲本对照数据，使用 miRanda 软件分析相应Cas9 RNA与所有已知的人类 miRNA 之间的结合可能性：其中结合可能性最高的51个miRNAs被命名“Cas9-miRNAs”，而69个不与Cas9结合的miRNAs被命名为“non-Cas9-miRNAs”。
在这331个细胞系中，研究者发现大多数“Cas9-miRNAs”的靶基因在很多细胞中存在Cas9 RNA导入后上调宿主细胞中相应miRNA的靶基因表达的趋势；而“non-Cas9-miRNAs”的靶基因就不存在这种趋势，这符合Cas9 RNA通过 miRNA 海绵机制发挥作用的假设。其中Let-7家族是Cas9 RNA的主要调节 miRNA（186种细胞在引入Cas9后，let-7i的相关靶基因普遍上调表达），此外qPCR和Western Blot实验也证实，在更多类型的细胞（U251、786-O、T98G 与 MCF7）在引入 Cas9 后，一些let-7i的靶基因显著上调。因此，Cas9 RNA可能充当了 microRNA 海绵，进而影响 Cas9-miRNA靶基因。
那么为什么 Cas9 的 miRNA 海绵效应在不同的细胞系中差异很大呢？
基于miRNA基础表达数据库（CCLE）和331个细胞系数据的联合分析后，团队发现let-7i相关Cas9敏感细胞的let-7i靶基因表达水平较低，而let-7靶基因的高频突变都分布在“Cas9不敏感”细胞中，即靶基因的表达量和突变等可能影响了Cas9 RNA发挥miRNA海绵效应。
优化 Cas9 RNA 序列可降低其对细胞增殖和let-7靶基因的影响
基于大多数 let-7下游靶基因是癌基因，而Cas9可以调节部分 let-7靶基因的表达，团队通过Cas9病毒载体/对照的细胞培养（例如人前列腺癌细胞系DU145）和体内实验，发现Cas9可轻度促进细胞增殖和细胞集落形成及肿瘤细胞的生长。因此有必要优化Cas9 RNA来提高该技术的安全性。
为了进一步验证miRNA海绵机制及在RNA水平上优化Cas9序列，研究人员构建了一个同义突变质粒（Cas9-Mut），发现Cas9-mut的mRNA可以被翻译成与Cas9相同的氨基酸序列。HEK293细胞的RNA-pulldown实验显示，相较于Cas9组，Cas9-mut与let-7的结合显著减少，转染 Cas9-Mut的DU145细胞的增殖能力和let-7靶基因上调能力也弱于转染Cas9的细胞，这给未来可以通过同义突变的方法进一步优化Cas9 RNA提供了可能。
为了确定优化后的Cas9-Mut是否仍然具有基因编辑功能，团队将Cas9-Mut和设计的 EGFP-gRNA引入稳定表达EGFP的HEK293细胞后，出现了一些EGFP阴性细胞；Cas9-Mu质粒和靶向UBXN4基因的gRNA转入DU145细胞也证实Cas9-Mut仍然具有基因编辑功能，这为其在实际应用中提供了支持。
海军军医大学王越、上海交通大学医学院附属第九人民医院秦兴军/王业飞，美国南加州大学的应其龙为论文的共同通讯作者，海军军医大学的蒋俊锋，曾韬，张莉和范杏飞为文章的并列第一作者。
原文链接:https://doi.org/10.1186/s12943-022-01604-x