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皮肤是身体最大的器官，由表皮和真皮组成，并包含毛囊(hair follicle, HF）等附属器官，在体温调节、身体保护、新陈代谢和感知等方面发挥重要作用。
毛囊(HF)形态发生可分为诱导期(Induction)、器官形成期(Organogenesis)和细胞分化期(Cytodifferentiation)三个阶段。在HF形态发生过程中，最初可观察到的结构是诱导期的毛囊基板(hair placode, Pc)。然而，早期胚胎皮肤细胞的时空转录组图谱还没有被完整地描述过，这对于人体皮肤相关疾病的研究非常重要。
（图片来源：M. R. Schneider, et al., Curr. Biol. 2009）
近期，烈冰生物合作伙伴中国农业大学丁向东教授团队在《Advanced Science》上发表了题目为“Integrating Single-Cell and Spatial Transcriptomics Reveals Heterogeneity of Early Pig Skin Development and a Subpopulation with Hair Placode Formation” 的文章。该研究整合单细胞转录组测序(scRNA-seq)和空间转录组(ST)数据，将不同时期同窝的有毛和无毛猪胚胎作为研究对象，描绘了猪胚胎早期皮肤发育的细胞异质性和毛囊形成关键的细胞亚群。
发表日期：2024年4月
发表期刊：Advanced Science
影响因子：IF=15.1
实验设计
图1 实验设计与分析原理图
实验分组：
7个猪胚胎的皮肤活检组织：
不同表型：无毛 vs. 有毛
不同胚胎发育时期：E37(预诱导期)、E41(诱导期)、E52(器官形成期)和E85(细胞分化期)
单细胞捕获平台：
10X Genomics 平台
主要技术手段：
单细胞转录组(scRNA-seq)测序、空间转录组(Visium ST)测序
Novelbrain云平台分析工具：
细胞聚类分析，SubCluster分析，差异基因表达分析，GO/Pathway分析，拟时序(Pseudotime)分析、CytoTRACE干性分析、细胞互作分析等
主要研究结果解析
01. 猪胚胎皮肤的单细胞和空间转录组图谱
7个猪胚胎的皮肤活检组织用于表型鉴定和scRNA-seq。为保证后续分析严谨可靠，研究者与烈冰的生信团队一起，从基因数量，线粒体，双细胞等角度对于数据进行质控和数据整合，最终共保留51,871个单细胞用于后续分析。通过UMAP聚类和细胞类型注释分析，得到25个细胞簇（Cell Cluster），鉴定为7种主要细胞类型；其中，真皮和表皮细胞在有毛和无毛猪组不同时期的比例一致。此外，免疫荧光分析（IF）与单细胞测序结果高度一致，进一步证明了数据注释准确。
图2 猪胚胎皮肤的单细胞和空间转录组分析（E41H、E41N、E52H、E52N、E85H、E85N分别代表E41、E52、E85的无毛和有毛猪胚胎，E37样本的表型无法确定，命名为E37U）
为了获得细胞在空间上的分布情况，研究者进一步进行了空间转录组分析（Visium ST），鉴定出了6种主要的细胞类型。这些细胞类型的空间分布与皮肤组织一致，并突出了真皮和表皮的清晰划分。各种细胞类型，包括免疫细胞、内皮细胞、周细胞和施旺细胞，都分散在真皮层内。这一观察结果与scRNA-seq结果一致，显示真皮占大多数比例（70%）。最后，相关性分析结果也表明，由scRNA-seq和Visium ST所鉴定的常见细胞类型之间具有高度的一致性。
02. 猪的表皮更能代表人类的表皮
研究团队整合了来自人和小鼠的公开的scRNA-seq数据，以比较不同物种的细胞类型。结果显示：猪在表皮、免疫系统和周细胞中表现出更多保守的细胞类型特异性标记基因。对于猪-人类保守的细胞类型特异性基因，PheGWAS全表型关联研究分析结果表明，这些基因与人类皮肤相关疾病密切相关。故相对于小鼠，猪的皮肤可以更准确地代表人类皮肤来研究与人皮肤-毛囊相关的复杂疾病。
图3 人、小鼠和猪的跨物种细胞图谱
03. 皮肤发育过程中的表皮细胞谱系
研究者对表皮细胞谱系（cluster5、18和20）进行SubCluster分析，得到9种细胞亚型。为了研究表皮细胞的演化过程，研究人员进行了拟时序分析，将表皮细胞分为两种谱系分化轨迹上的五种发育状态，描述了在表皮发育和毛囊（HF）形态发生过程中发生的基因表达变化。其中，E37主要位于state1的初始位置，E85（N & H）位于state5，E41（N & H）和E52（N & H）位于轨迹的中部。结合差异基因表达分析的结果，表明毛囊基板（Pc）是HFs中最具特征性的初始结构。来自于祖细胞样的OGN+/UCHL1+细胞。最后，IF验证也与scRNA和ST的结果一致。
图4 在皮肤发育过程中，表皮细胞的命运演化
04. 皮肤发育过程中的真皮细胞谱系
对真皮细胞谱系进行SubCluster分析，得到2种主要的细胞亚型：乳头状成纤维细胞（APCDD1和AXIN2）和网状成纤维细胞（MFAP5和COL11A1）。结合空间转录组分析（Visium ST）的结果，真皮细胞亚型在组织中的空间定位与组织学上确定的解剖位置一致。
使用Monocle2和CytoTRACE，拟时序分析将真皮成纤维细胞分为三种状态，其中state1产生了两种不同的细胞命运。为了研究胚胎期真皮成纤维细胞异质性的起源，state1的细胞在E37处分离进行亚聚类分析。基于先前报道的乳头状成纤维细胞（APCDD1）、网状成纤维细胞（COL11A1）和成纤维细胞祖细胞的标记物，研究人员确定了真皮成纤维的细胞来源。
图5 真皮成纤维细胞的异质性起源
05. 早期HF发育中Pc的祖细胞起源
在有毛猪中，Pc的形成可从E37（预诱导期）持续到E41（诱导期）；相比之下，无毛猪缺乏Pc细胞。因此，研究者假设无毛猪的Pc形成是异常的。为了验证这一假设，使用CytoTRACE来对表皮细胞进行干性评分，研究结果支持假设，即在HF形态发生过程中，无毛表型发生在E37和E41之间。此外，研究者通过拟时序分析和细胞互作等分析，揭示了两种细胞分化轨迹，一种是OGN+/UCHL1+细胞→TC1→TC2导致正常Pc形成，另一种则是从OGN+/UCHL1+细胞→TC1→TC3导致上皮细胞发育；进一步研究表明，在无毛猪中，OGN+/UCHL1+细胞在增殖和迁移过程中的异常导致Pc形成异常，而BMP和TGFβ是触发OGN+/UCHL1+细胞发生Pc形成的第一个信号通路。
图6 毛囊基板（Pc）形成过程中的分子机制和转录调控网络
全文总结
研究团队使用单细胞和空间转录组技术，首次在时空分辨率上表征猪皮肤发育过程中的单细胞和空间转录组图谱。在表皮中，研究人员发现了两种分化轨迹，分别描述了毛囊(HF)形态发生和表皮发育的过程。通过比较有毛和无毛猪胚胎，发现HF中最典型的初始结构—毛囊基板(Pc)来自于祖细胞样的OGN+/UCHL1+细胞。本研究为深入了解HF的发育提供了宝贵的资源，可作为利用猪模型研究人类皮肤病病因学的关键参考图谱。
原文链接：
https://doi.org/10.1002/advs.202306703
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撰稿/排版：烈冰市场部