肾细胞癌（RCC）是世界上最常见的十大恶性肿瘤之一，主要表现为透明细胞性肾细胞癌（ccRCC）。ccRCC是最常见的肾细胞癌病理亚型，约占肾细胞癌的60%～85%，侵袭性强，转移率和死亡率高。代谢失调是ccRCC的一个关键特征，迄今为止，大多数临床代谢组学研究只关注代谢组学分析，单细胞和空间组学技术的发展有助于以更高的分辨率探索ccRCC中的肿瘤微环境（TME）图谱。

      本期，小编就来介绍一下烈冰生物合作伙伴华中科技大学同济医学院附属同济医院谌科教授、陶振教授、管维教授和海军军医大学附属长征医院任善成教授发表在《Nature Genetics》的文章，题目为“Multi-omic profiling of clear cell renal cell carcinoma identifies metabolic reprogramming associated with disease progression”。这篇文章对同济医院100例ccRCC患者（TJ-RCC）队列使用多组学联合分析，发现了一个独特的亚型：DCCD-ccRCC。并通过单细胞和空间轨迹分析，证明了DCCD是ccRCC进展的一种常见模式，揭示了ccRCC的进展机制。烈冰生物提供了单细胞核测序实验的相关服务。

发表日期：2024年2月

发表期刊：Nature Genetics

影响因子：IF=30.8

实验设计

• 单细胞捕获平台：10X Genomics

• 主要技术手段：

1. 全外显子测序（WES）、全转录组测序（WTS）、蛋白质组学、非靶向代谢组学：100份未经治疗的ccRCC样本、50份配对的正常邻近组织（NATs）样本

2. 单细胞核测序（SnRNA-seq）：不同亚型的ccRCC样本（n=10）

3. 单细胞ATAC-seq（SnATAC-seq）：不同亚型的ccRCC样本（n=10）

4. 空间转录组测序：不同亚型的肿瘤切片（n=12）和配对的NAT对照组（n=2）

主要研究结果解析

01 多组学描述同济医院RCC（TJ-RCC）队列的分子特征

      研究团队使用全外显子测序（WES）、全转录组测序（WTS）、蛋白质组学和非靶向代谢组学（包括LC-MS和GC-MS）等技术，对100份未经治疗的ccRCC样本和50份配对的正常邻近组织（NATs）进行了分析。基因组的分析结果表明本研究中最频繁的突变基因与之前的研究一致；转录组和蛋白组的数据表明，肿瘤和正常临近组织（NATs）之间有显著的区别。代谢组学分析结果与转录组和蛋白质组分析的结果一致，并发现ccRCC的一个标志，即脂滴（LDs）的积累可能是由β-氧化活性降低引起的。

02 ccRCC可分为四种免疫亚型

      研究团队从一个公开的scRNA-seq数据集生成了一个ccRCC的特征矩阵，并确定了25种不同的细胞类型。该矩阵将肿瘤样本分为四种免疫亚型（IM1- IM4）。其中，IM1肿瘤的特征是内皮细胞和基质细胞特征丰富，免疫细胞特征缺乏；IM2肿瘤也具有丰富的内皮信号，而免疫细胞和基质细胞特征缺乏。在四个亚型中，IM3肿瘤的内皮细胞和基质细胞特征水平最低，但T细胞和肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）评分增加，IM4肿瘤的基质细胞和TAM评分最高，T细胞评分居中。

03 单细胞测序表征免疫亚型中细胞组成的异质性

      为了进一步研究四种IM亚型的免疫细胞组成异质性，对10个样本（4个IM1、2个IM2、2个IM3和2个IM4）进行了单细胞核转录组测序（snRNA-seq），另外10个样本（1个IM1、3个IM2、4个IM3和2个IM4）进行了单细胞ATAC测序（包括snRNA-seq 和单核ATAC测序snATAC-seq）。经过质控，最终97,978个单核细胞分为5种主要细胞类型和41个亚群，并发现四种免疫亚型中的免疫细胞组成有较大区别。

      在IM1和IM2亚型中，单核细胞、LILRB5⁺巨噬细胞（Mø03-LILRB5）、终末分化的效应记忆或效应细胞（TEMRA）和活化的NK（aNK）细胞占主导地位。在IM3亚型中，CD8⁺T细胞浸润增加。并且IM3和IM4肿瘤的TAMs存在显著差异。在IM3肿瘤中富集了GPNMB⁺巨噬细胞（Mø04-GPNMB）、C3⁺巨噬细胞（Mø06-C3）和GBP1⁺巨噬细胞（Mø07-GBP1），而IM4肿瘤中IGF1⁺巨噬细胞更为丰富。随后的免疫荧光染色验证了IGF1⁺巨噬细胞（F13A1⁺）主要定位于成纤维细胞（PDGFRA⁺）富集区域，这支持IGF1⁺巨噬细胞促进IM4肿瘤中成纤维细胞的积累。

04 空间组学揭示TME中的免疫和代谢异质性

      联合分析显示，在转录组和蛋白质组水平上，IM3样本中的胞苷、嘧啶和其他核苷代谢相关途径均增强；随后，研究团队基于TCGA KIRC公共数据集，对Teff细胞的单样本基因集富集分析（ssGSEA）评分与嘧啶代谢的相关性分析表明，嘧啶/胞苷代谢活性增加与CD8⁺ T细胞浸润增加和不良预后相关，与在TJ-RCC队列中的发现相一致。此外，在代谢组数据中观察到IM3样本中嘧啶衍生物的增加。然而，尽管IM3是一个CD8⁺ T细胞浸润的亚组，但IM3肿瘤的预后仍优于IM4肿瘤，这些结果提示CD8⁺ T细胞浸润可能限制ccRCC的肿瘤进展。

      为了证实上述结果，研究团队对12个肿瘤切片（4 IM1、4 IM2、3 IM3和1 IM4）和2个配对的NAT对照组进行了空间转录组学（ST）和空间代谢组学分析。在属于IM3组的CD8⁺ T细胞浸润样本（R29_T）中检测到高鸟嘌呤和次黄嘌呤信号，相反，在另一个具有局部淋巴细胞浸润的IM3样本中，仅在非TIL浸润区域检测到微弱的鸟嘌呤和次黄嘌呤信号。这些结果表明了ccRCC的瘤内异质性（ITH），以及嘧啶衍生物与TILs之间的潜在相关性。这一假设在另一个局部CD8⁺ T细胞浸润的样本中得到了进一步的证实。

05 DCCD表现出独特的代谢特征，预后较差

      由于脂肪酸和氨基酸代谢通路在IM4亚型中下调，同时这些通路在ccRCC肿瘤中也下调。为了系统地研究这些差异，研究团队鉴定了IM4和其他肿瘤亚型之间的差异表达基因（DEGs），通过聚类分析，共将853个DEGs聚为4个基因modules。在IM4中，module 1和module 2中的基因表达水平高于其他IM，但module 1的基因在NATs中的表达水平最高。对NATs的snRNA-seq数据分析显示，module 1的基因主要在肾小管细胞中表达，module 2的基因主要在集合管中表达，module 3的基因在正常近端小管中显著表达，在非IM4肿瘤中下调，但在IM4肿瘤中进一步降低，并且这些基因在脂肪酸、氨基酸和碳水化合物的代谢中富集。ccRCC致癌基因，HIF2A也包含在这个module中，这些基因导致肿瘤细胞中脂滴（LDs）的积累。由于这些特征在IM4肿瘤中大部分被抑制，与module 4相关的特征可能对ccRCC有双重作用。

      通过对20个随机选择的TJ-RCC队列样本进行油红O（ORO）染色验证，发现在非IM4样本中表现出“透明细胞”表型的脂滴（LDs）积累，但在IM4样本中几乎没有观察到LDs，与转录组特征一致。代谢组学分析也证实了IM4肿瘤中的代谢重编程。综上所述，IM4肿瘤的特征包括营养摄取增加、活性氧（ROS）和脂滴（LDs）水平降低、低代谢活性和较高的增殖率。由于ccRCC的特征是在癌细胞中LD的积累，研究团队将这一过程命名为ccRCC的去透明细胞分化（DCCD）。此外，由于IM4肿瘤已经完成了这一转化过程，将其称之为DCCD-ccRCC。此外，研究团队发现原发肿瘤被分层为DCCD肿瘤的患者总生存期（OS）和无进展生存期（PFS）明显较差，表明局限性DCCD-ccRCC患者应被识别并给予进一步治疗。

06 从非DCCD到DCCD的转变

      对snRNA-seq数据的分析显示，与在bulk RNA-seq数据中观察到的IM2和IM4评分之间存在相同的负相关关系。因此，根据DCCD评分将单个癌细胞分为IM2-like或IM4-like表型，表明DCCD过程反映了肿瘤内IM4-like癌细胞的积累。由于DCCD-ccRCC通常比IM1-IM3肿瘤包含更多的臂水平体细胞拷贝数变异（SCNAs），因此作者接下来想探究SCNA是否驱动了DCCD过程。

      在12个ccRCC样本的切片中，有两个样本发现了部分DCCD，其中，Y7_T样本在bulk RNA-seq和snRNA-seq数据中都显示出IM2的特征，在Visium切片中显示出一个亚克隆的DCCD转移，反映了DCCD诱导的ITH。非DCCD区域表现出经典的“透明细胞”表型，与前面ORO染色观察到的表型一致。综上结果表明SCNA事件与DCCD之间没有绝对的相关性。空间代谢组分析显示，无论是否存在亚克隆SCNA，DCCD区域的脂肪酸（尤其是长链脂肪酸）都较少，从而导致这些区域的LD积累减少。

07 单细胞核测序建立了DCCD的轨迹

      为了更深入地了解向DCCD的转化过程，研究团队使用snRNA-seq数据进行轨迹分析，IM4-like单细胞的中心位于轨迹的末端，结果显示，在整个拟时序时间内，IM4评分增加，IM2评分下降。随后，通过差异分析，83个差异表达的转录因子被分为两个cluster。HIF1A是RCC的传统肿瘤抑制因子，在向DCCD分化的后期阶段显著升高。两个样本的空间轨迹与snRNA-seq数据的结果一致。使用Monocle 2进行轨迹分析，参与DCCD的关键转录因子的连续变化在bulk RNA-seq和单核测序数据中高度一致。

      对snATAC-seq数据进行的ChromVAR偏差分析，揭示了DCCD和非DCCD群体中差异最大的激活转录因子，AP-1转录因子亚基排在首位，其次是BACH1、BACH2和肝细胞核因子家族成员。最后，基于scMEGA分析，作者为DCCD和非DCCD癌细胞构建了不同的基因调控网络。综上所述，这些数据为深入了解参与ccRCC进展的转录因子调控网络提供了新的见解。

全 文 总 结

      本研究中，研究团队首次使用多组学数据联合分析，揭示了透明细胞性肾细胞癌（ccRCC）中存在四种代谢亚型，并确定了一个具有独特代谢特征的亚型-去透明细胞分化（DCCD）-ccRCC，其特征包括营养摄取增加、活性氧（ROS）和脂滴（LDs）水平降低、低代谢活性和较高的增殖率。此外，通过单细胞和空间轨迹分析技术，研究团队还深入研究了ccRCC与疾病进展相关的代谢重编程，并发现ccRCC中的DCCD与不良预后相关，为ccRCC患者的精准治疗和预后评估提供了新的见解。

原文链接：

https://doi.org/10.1038/s41588-024-01662-5

转载请注明 “烈冰生物”

撰稿/排版：烈冰市场部