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烈冰生物助力哈尔滨医科大学蒋庆华教授、孙皓修博士团队联合南方医科大学徐江平教授团队在《Nature Communications》发表文章“Charting the spatial transcriptome of the human cerebral cortex at single-cell resolution”。烈冰生物参与了本研究中的单细胞核测序实验工作，凭借卓越的技术实力和数据质量，为本研究的顺利发表提供了坚实保障！
发表日期：2025年8月
发表期刊：Nature Communications
影响因子：IF=15.7
一、研究背景和方法
研究背景
人类大脑皮层是高级认知功能的物质基础，其复杂的细胞组成与空间结构一直是神经科学研究的核心。尽管前人研究已初步揭示了皮层细胞的多样性，但全面揭示其分子特征、区域特异性分布及细胞互作网络仍需更高精度的技术手段。传统方法在通量、分辨率与空间信息整合方面存在局限，难以构建真正意义上的全皮层、单细胞精度的三维分子图谱。本研究整合了snRNA-seq与Stereo-seq空间转录组技术，成功绘制了覆盖14个不同功能区的人类大脑皮层高分辨率单细胞空间转录组图谱，为理解大脑细胞组成、空间结构及神经疾病机制提供了宝贵洞见。
实验设计
样本来源：
使用来自5名无神经系统疾病成年捐赠者的42个新鲜样本进行snRNA-seq。
使用来自9名捐赠者的44个冠状脑切片进行空间转录组测序（Stereo-seq）。
样本覆盖14个皮层区域，包括前额叶、运动皮层、视觉皮层等。
单细胞捕获平台：10x Genomics
主要技术手段：snRNA-seq、Stereo-seq、免疫组化（IHC）等。
分析方法：细胞聚类分析、细胞互作分析、功能与区域关联分析、差异表达与通路分析等。
二、主要结果
1、人脑皮层基于转录组学的细胞类型分类学体系
本研究通过整合自测与公开BICCN数据集（Fig.1a,b），对5名无神经系统疾病成年个体的14个皮层区域的42个样本进行了大规模snRNA-seq，共获得307,738个细胞核的转录组数据。通过与BICCN数据整合，总数据量达到1,121,772个细胞核，极大地增强了研究的统计效力（Fig.1b）。为进一步解析细胞的空间分布特征，研究还利用Stereo-seq技术对44张组织切片进行了空间转录组测序，覆盖了前额极前额叶皮层（FPPFC）、背外侧前额叶皮层（DLPFC）、前扣带回皮层（ACC）、初级视觉皮层（V1）等14个关键皮层区域（Fig. 1c）。
基于转录组分子特征，研究建立了层次化的细胞分类系统，定义了3个大类、22个亚类和153种细胞类型（Fig.1d）。研究发现特定细胞类型表现出明显的区域分布偏好：谷氨酸能亚型LINC00507_3和LINC00507_4在初级运动皮层中更为富集，而RORB+细胞主要分布在初级视觉皮层V1的颗粒层周围。
图1.人类14个皮层区域的全面空间转录组图谱
此外，方差分析表明性别因素对基因表达及细胞组成差异贡献极小（<1%），但性别相关差异表达基因在GABA能神经元和非神经元细胞中显著富集于自闭症谱系障碍（ASD）相关通路，提示性别偏好基因表达与ASD易感性存在潜在关联。
2、空间转录组学揭示了人类大脑皮层中的层状结构
为精确识别皮层内的空间域（即各层结构），研究者整合了组织学（H&E和ssDNA染色）与基因表达等多模态数据，采用基于图的深度学习框架DeepST进行聚类分析（Fig.2a）。研究发现，不同皮层在基因表达模式和层状特异性细胞类型上存在显著差异（Fig.2b）。一系列经典的层状标志基因表现出高度的层状特异性和表达连续性，如RELN（L1）、LAMP5/LINC00507（L2）、CUX2/COL5A2（L3）、PCP4（L5）、CCN2/THEMIS（L6）及MBP（白质WM）等（Fig.2b）。同时，通过分析各层差异表达基因（DEGs），我们还发现了一批新型的非经典层状标志物，如CXCL14（L1）和NEFM（L3），它们在14个新皮层区域中均表现出良好的标记稳定性（Fig.2c,d）。尽管某些层共享部分生物学功能（如L1-L4层共同富集神经递质分泌调控），但各层整体具备独特的转录组特征和分子功能（Fig.2c）。
图2.人类皮层区域的空间转录组学分析和Stereo-seq鉴定的层特异性标志基因的层富集
3、谷氨酸能神经元的空间表型异质性
基于单细胞转录组数据，研究者将谷氨酸能神经元依据其投射模式划分为9个亚类（Fig. 3）。其中，端脑内投射（IT）神经元构成了一个连续的转录组谱系，其空间位置呈现出高度相关的渐变性变化。具体包括分布于颗粒层上的L2-L3 IT LINC00507、跨越颗粒层上下的L3-L4与L4-L5 IT RORB、以及位于第5层以下的L6 IT四个亚类。其他转录定义的亚类还包括端脑外投射（ET）、近端投射（NP）、表达Car3的L6神经元（L6 CAR3）、皮质丘脑投射（CT）和第6b层神经元（L6b）。不同亚类具有截然不同的分子与功能特征：例如，位于第5层的ET神经元高表达CTIP2/BCL6，这些基因与轴突维持、长距离信号传递和远端突触连接密切相关；NP神经元则特异高表达SYT6，擅长局部环路中的短程突触传递；而第6层的CT神经元表达FOXP2，其长轴突支持与丘脑的精确连接。
跨皮层区域的分析表明，空间相邻脑区的谷氨酸能神经元具有更高的转录组相似性，这种趋势在颞叶（ITG和STG）以及角回连接的顶叶三角区（AG、SMG和SPL）中尤为明显。进一步对四个IT亚类进行的差异表达分析发现，尽管相邻区域表达模式相似，每个IT亚类仍具有其独特的标志基因，这些标志基因在全部14个皮层区域中均能稳定识别相应的亚类。
研究者通过多因素分析揭示了影响谷氨酸能神经元转录组变异的关键因素（Fig.4a）：IT神经元亚类的表达差异主要受层状结构变化驱动，而非脑区特异性。细胞组成分析发现，前扣带回皮层（ACC）中浅层IT神经元（L2-L3 IT）比例显著低于其他区域（Fig.4b,c）。免疫组化染色验证ACC缺乏清晰的第4层，且浅层神经元较少，但其第5层较宽、灰质比例较高，并存在端脑外投射（ET）神经元（Fig.4d）。
图4.疼痛相关皮质区域中ET神经元的区域特异性分布与功能富集分析
通过整合Neurosynth功能磁共振元分析数据库，研究发现高阶认知功能（如工作记忆）与前额叶中RORB神经元的高密度相关，而初级感觉功能（如疼痛）则与中央沟附近的ET神经元密切相关（Fig.4e）。疼痛相关脑区（包括ACC、S1、PoCG）的第5层中ET神经元密集分布（Fig.4f）。分子鉴定表明，ACC中的ET神经元高表达 GNA15、LYPD1和NEUROD1 等基因（Fig.4g），这些细胞可能包含Von Economo神经元（VEN），但其分子特征与脑岛区域的VEN有所不同。功能富集分析显示ACC中的ET神经元显著参与共翻译蛋白靶向膜过程及细胞质翻译等生物学过程（Fig.4h）。
4、非神经元细胞和GABA能神经元的细胞结构
GABA能神经元按发育起源分为CGE来源（LAMP5、NDNF、PAX6、VIP）和MGE来源（CHANDELIER、PVALB、SST）两大类，分别占比45%和55%（Fig.5a）。CGE来源神经元倾向于分布在浅层，尤其NDNF神经元显著富集于表层（Fig.5b），而MGE来源神经元无显著层状限制。
进一步研究发现，MGE来源的SST神经元形成明显的浅层与深层两大家族（Fig.5c,d）。深层SST神经元中20个基因显著上调（Fig.5e），而浅层SST神经元高表达CALB（Fig.5f）。功能上，深层SST家族富集于G蛋白偶联神经递质受体活性，浅层家族则与cAMP磷酸二酯酶活性相关（Fig.5g）。空间转录组分析证实，浅层标志基因（如PDZD1、GNAL）在浅层表达，而深层标志基因（如DCC、TRHDE）在深层共表达（Fig.5h），表明其分布模式可能源于发育中不同的迁移路径。
图5.人皮质区域GABA能亚类的特征及空间分布
本研究发现，人类皮层中少突胶质前体细胞（OPCs）的比例显著高于非人灵长类，且调控OPC成熟的基因（如FOXP2、THEMIS、PCDH15）在人类中表达更高，这些基因共表达细胞在第六层和白质（WM）以及顶叶（SPL）和背外侧前额叶（DLPFC）中分布较多（Supplementary Fig.5e,f）。非神经元细胞各亚类呈现层状分布异质性，如少突胶质细胞（OLIGO）富集于白质，而OPC广泛分布各层（Supplementary Fig.5g,h）。星形胶质细胞被分为5个亚群，其中Astro4和Astro5在ACC中比例和密度显著高于其他皮层区域（Supplementary Fig.5i–l），且Astro5更多位于白质。基因表达分析进一步发现Astro4特异性表达TMEM144，而Astro5特异性表达SGK1（Supplementary Fig.5m）。
补充图5
5、14个人脑皮质区域的细胞相互作用
基于高分辨率空间转录组技术（Stereo-seq），研究者通过分析细胞间的空间邻近性系统地推断了皮层中的细胞互作网络（Fig.6a）。研究发现，除非神经元细胞自身之间的互作外，它们与某些层状限制性兴奋性神经元之间亦存在频繁的空间邻近接触（Fig.6b）。进一步对不同脑叶的分析表明，IT神经元亚类在各脑叶中均表现出显著层状特异性的互作模式；尤为值得注意的是，GABA能神经元在颗粒下层（L5-6）中与IT神经元的互作频率高于与CT、NP神经元的互作，非神经元细胞中未发现类似趋势（Fig. 6c）。跨皮层区域的比较显示，前扣带回（ACC）和初级视觉皮层（V1）具有显著不同于其他区域的互作模式，可能与其特有的层状结构有关（Fig.6d–f）。
在配体-受体互作分析中，星形胶质细胞主要通过三对关键分子对与神经元发生联系：NRG3-ERBB4、NRXN1-LRRTM4 和 NRXN1-NLGN1；相比之下，小胶质细胞则表现出更为多样化的配体-受体互作模式（Fig.6g）。跨区域分析显示，小胶质细胞与神经元互作组合在不同脑区具有较高多样性（Fig.6h,i），而星形胶质细胞与神经元的互作组合在初级体感耳鼓皮层（S1E）中比例尤为突出（Fig.6j）。
图6.人脑皮层细胞间的相互作用
6、人脑皮层第4层和亚板区的空间转录组学
基于构建的细胞图谱，本研究深入解析了第4层（L4）的细胞构成与分子特征。分析显示，L3-L4 IT与L4-L5 IT RORB谷氨酸能神经元在初级视觉皮层（V1）中占主导地位（Fig.7b,c），且V1中第4层在灰质中的厚度比例显著高于其他皮层区域（Fig.7d），这与RORB神经元的显著富集密切相关（Fig.8a,b）。
图7.谷氨酸能亚类在14个皮质区域的空间分布和层状组织
跨区域比较发现，V1的第四层中基因ADAMTS3和FFAR4显著下调（Fig.8c），而颞叶区域（ITG、STG）的第四层则表达与精神分裂或神经退行性疾病相关的基因LRRC73和OGN（Supplementary Fig.7）。通过高分辨率空间转录组半监督聚类，研究进一步将V1的第4层精细划分为L4a、L4b、L4c三个子层（Fig.8d,e），并鉴定出各子层的特异性分子标志物：EGR1（L4a）、NEFH与SYT2（L4b）、CD74和CNTN5（L4c），原位 Stereo 组织切片验证证实了这些标志物具有很高的层状特异性（Fig. 8f）。
图8.视觉皮层中RORB谷氨酸能神经元的空间变化
三、总结
本研究通过整合snRNA-seq与Stereo-seq空间转录组技术，成功构建了涵盖14个功能皮层区域、高分辨率的人类大脑细胞图谱，系统解析了超150种细胞类型的分子特征、空间分布规律及互作网络。不仅揭示了谷氨酸能神经元与GABA能神经元的层状分布规律和投射多样性，还发现了人类特有的神经结构特征——如SST神经元在皮层浅层与深层形成两个主要亚群，且其分子机制与小鼠存在显著差异。这些发现为理解人类大脑感知、认知和行为的细胞学机制提供了全新视角，也为神经疾病的精准诊治奠定了坚实基础。
烈冰助力
此篇顶刊的发表，不仅是学术界对大脑认知领域的又一重大突破，也是对烈冰生物在单细胞测序领域技术实力、项目执行力及数据质量的极高认可。它充分证明了烈冰生物有能力支撑和服务于最具挑战性的前沿科研项目，助力客户产出里程碑式的研究成果。
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